枸橼酸铁铵和脂多糖对星形胶质细胞LCN2表达的影响及机制

唐硕,徐华敏,谢俊霞

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东青岛 266071)

帕金森病(PD)作为一种常见的神经退行性疾病,主要以黑质(SN)多巴胺(DA)能神经元的缺失以及嗜酸性路易小体(LBs)的形成为特点[1]。尽管PD 的主要发病机制尚未完全阐明,但包括神经炎症在内的多种因素均可能参与了PD 的发病。导致神经退行性变的神经炎症活动主要由固有免疫细胞(如活化的小胶质细胞和星形胶质细胞)介导,这些细胞能够产生活性氧中间体、一氧化氮和炎性细胞因子等[2-5]。因此,阐明神经炎症机制和调控神经胶质细胞激活对于保护PD 病人SN 区DA 能神经元至关重要。SN 铁沉积是PD 病人和PD 动物模型的重要特征[6-7]。脂质运载蛋白-2(LCN2)是一种先天性免疫蛋白,在生理和炎症条件下作为重要的铁调节蛋白发挥作用[8]。脂多糖(LPS)能够与脂多糖结合蛋白(LBP)结合,由CD14分子介导LPS向细胞内传递,导致核因子κB(NF-κB)激活,诱导炎性细胞因子表达[9]。MG132是蛋白酶体抑制剂,同时还可以抑制蛋白酶体介导的NF-κB 活化[10-11]。研究发现,LCN2基因的启动子含有NF-κB及增强子结合蛋白(C/EBP)的结合位点,提示其表达可能受到NF-κB的调控[12]。然而,蛋白酶体、NF-κB 通路是否参与LPS诱导的LCN2表达尚不清楚。因此,本研究观察了铁负载试剂枸橼酸铁铵(FAC)和LPS以及MG132诱导的原代星形胶质细胞中磷酸化的核转录因子(P-NF-κB)和LCN2表达的变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMEM/F12培养液购自美国Hyclone公司,青霉素和链霉素双抗购于碧云天公司,多聚赖氨酸、LPS、FAC均购于美国Sigma公司,MG132购于美国Selleck公司,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司,BCA 蛋白浓度测定试剂盒、分离/浓缩胶缓冲液、RIPA 裂解液购于中国康为世纪公司,兔源β-actin抗体购于博奥森公司,LCN2抗体购于美国R&D 公司,P-NF-κB和NF-κB购于美国CST公司。

1.2 细胞培养及实验分组

将新生24 h的Wistar大鼠乳鼠脱颈处死,取中脑,除去脑膜和血管,用枪头吹打形成单细胞悬液。将悬液置于大离心管中,在4 ℃下以1 000 r/min离心5 min,弃上清,重悬于含有体积分数0.10胎牛血清、100 k U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEMD/F12细胞培养液中,吹打混匀。将细胞接种到培养瓶中,置37 ℃、含体积分数0.05 CO2的无菌细胞培养箱中培养48 h。2 d后,更换新鲜培养液以除去未贴壁细胞,将贴壁细胞继续培养10 d,每3 d更换一次新鲜培养液。当细胞铺满瓶底90%以上时,将培养瓶置于恒温(37 ℃)摇床上,以200 r/min的转速摇17～20 h,以去除小胶质细胞和少突胶质细胞,清洗细胞,再用胰蛋白酶消化细胞,收集细胞接种于6孔板,进行后续的实验。将细胞分为对照组(A 组)、FAC 组(B 组)、LPS 组(C 组)、FAC+LPS组(D 组)和MG132+LPS组(E 组),对照组用细胞培养液培养,FAC 组和LPS 组分别用FAC和LPS处理24 h,FAC+LPS组先用FAC预处理4 h后再用LPS处理24 h,MG132+LPS组先用MG132预处理4 h后再用LPS处理24 h。

1.3 蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测PNF-κB和LCN2蛋白表达

细胞处理结束以后,吸除培养液,每孔加入100μL裂解液,冰上静置30 min,用刮子将细胞刮下来,置于提前准备好的1.5 m L 的EP 管中,在4 ℃下以12 000 r/min离心30 min。吸取80μL的细胞上清置于新的EP管中,用BCA 试剂盒测定蛋白浓度,按照每孔20μg蛋白计算上样体积,电泳(80 V、1 h,120 V、1 h),然后将蛋白湿转到PVDF膜上(30 m A、90 min)。使用50 g/L奶粉封闭2 h,加入β-actin 一抗(1∶10 000)、LCN2 一抗(1∶1 000)、P-NF-κB一抗(1∶1 000)、NF-κB 一抗(1∶1 000),置4 ℃恒温摇床上过夜,16 h后,用TBST洗膜3次,每次10 min。分别加入山羊抗兔(1∶10 000)、兔抗山羊(1∶10 000)的二抗,室温下置摇床上1 h,用TBST 洗膜3次,每次10 min;使用化学发光液进行显影。

1.4 统计学分析

应用Graphpad Prism 软件进行统计学分析。计量资料以±s表示,多组比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),然后用Turkey法进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FAC 和LPS诱导的原代星形胶质细胞中PNF-κB蛋白表达的变化

各组P-NF-κB蛋白表达水平比较差异具有统计学意义(F=11.76,P＜0.01)。FAC处理后,细胞中P-NF-κB 蛋白表达与对照组比较无明显变化(q=0.469,P＞0.05);LPS 处理后,P-NF-κB 蛋白表达水平升高,与对照组相比差异具有统计学意义(q=5.859,P＜0.01);FAC+LPS处理后,P-NF-κB蛋白表达水平与LPS组相比较差异无显著性(q=1.516,P＞0.05),与对照组和FAC组相比差异具有统计学意义(q=7.376、6.907,P＜0.01);MG132+LPS处理后,P-NF-κB蛋白表达与LPS组相比明显下降,差异具有统计学意义(q=4.939,P＜0.05)。见表1。

2.2 FAC和LPS诱导的原代星形胶质细胞LCN2蛋白表达的变化

各组LCN2蛋白表达水平比较差异具有统计学意义(F=68.18,P＜0.01)。FAC处理后,细胞中LCN2蛋白表达与对照组比较无明显变化(q=0.655,P＞0.05);LPS 处理后,LCN2 蛋白表达升高,与对照组相比差异具有统计学意义(q=16.170,P＜0.01);FAC+LPS处理后,LCN2蛋白表达水平与LPS组相比差异无显著性(q=1.512,P＞0.05),与对照组和FAC组相比差异具有统计学意义(q=14.650、13.990,P＜0.01);MG132+LPS 处理后,LCN2蛋白表达与LPS组相比明显下降,差异具有统计学意义(q=15.710,P＜0.01)。见表1。

表1 各组星形胶质细胞中P-NF-κB 和LCN2 蛋白表达的比较(±s)

表1 各组星形胶质细胞中P-NF-κB 和LCN2 蛋白表达的比较(±s)

P-NF-κB和LCN2 蛋白表达组间比较,F=11.76、68.18,P ＜0.01。

组别P-NF-κB(n=8)LCN2(n=4)A 组0.845±0.029 0.173±0.021 B组0.880±0.071 0.210±0.046 C组1.289±0.108 1.081±0.080 D组1.404±0.068 0.996±0.079 E组0.914±0.081 0.199±0.022

3 讨 论

PD 是第二大常见的神经退行性疾病,以中脑SN 的DA 能神经元选择性死亡为特征[1]。研究已经证明,PD 发病与年龄老化、环境因素、遗传因素、氧化应激和自由基形成等有关,近年来越来越多的证据表明,神经炎症和铁在PD 的进展中起关键作用[13-15]。目前的研究表明,PD 病人的SN 中铁选择性升高,并且铁的积累程度与PD 的疾病严重程度相关[15-17]。在动物模型中,将不同浓度的FeCl3(分别含1、5和50μg的Fe3+)单侧注射到成年大鼠的SN 中,两种较低剂量的铁对DA 水平和大鼠的行为反应没有影响,但是注射50μg的Fe3+会导致DA能神经元的显著降低[18-19]。有文献报道,LPS的全身注射可促进小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞活化并增高促炎细胞因子水平[20]。PD 病人的尸检结果显示,其DA 能神经元大量丧失,小胶质细胞活化,一氧化氮、肿瘤坏死因子、白细胞介素和其他促炎细胞因子水平增高[21-22]。

有文献报道,在PD 病人大脑中观察到LCN2表达的显著上调,并且SN 和纹状体中的LCN2表达上调要明显高于海马和大脑皮质,LCN2水平增高将加重神经毒性和神经炎症,导致DA 能神经元的破坏和异常运动行为[23]。还有研究显示,与野生型小鼠相比,在LCN2-/-小鼠中,颅内出血(ICH)引起较低的铁蛋白上调、小胶质细胞活化、脑肿胀、脑萎缩和神经功能缺损,FeCl2引起的病变程度以及脑肿胀和血-脑脊液屏障(BBB)破坏的程度也较轻,表明LCN2在ICH 后增强脑损伤和铁毒性中起作用[24]。有文献报道,LCN2-/-小鼠的脑梗死体积、神经系统评分、BBB 通透性、神经胶质激活和炎性递质表达等均明显低于野生型小鼠[25]。大量的研究表明,LCN2在中枢神经系统中起着重要作用,但是目前对LCN2 的产生机制却知之甚少。本文研究结果显示,高铁状态对P-NF-κB和LCN2蛋白的表达没有影响,LPS则可促进P-NF-κB和LCN2的表达,用MG132预处理可以下调LPS对P-NF-κB和LCN2的诱导作用。提示MG132可能是通过抑制NF-κB途径而起到抑制LCN2表达的作用,LPS可能通过P-NF-κB 上调星形胶质细胞LCN2的表达,参与PD 神经炎症的进展。