柔肝化纤颗粒治疗肝肾阴虚型乙肝后肝纤维化的疗效及作用机制*

段桂姣，王振常，蒋锐沅，郝蔷薇，吕艳杭，农小欣，符燕青，苏晓文

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；2.广西国际壮医医院，广西 南宁 530301）

肝纤维化是由多种慢性损肝因素所致的肝星状细胞的增值、活化，肝脏细胞外基质过度沉积，肝功能异常的病理改变，是各种慢性肝病发展的最终共同途径，在我国多由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致。研究[1]证实，我国超过60%的肝硬化及80%的原发性肝癌与HBV感染有关。因此，加强乙肝后肝纤维化的防治值得进一步研究与推广。相关研究证实，在感染HBV的自然病程中，从免疫耐受期至免疫清除期T淋巴细胞参与免疫调节，持续存在的HBV感染会导致HBV-DNA数量的异常，丙氨酸氨基转移酶（ALT）反复升高，正常肝细胞凋亡及肝脏组织炎症或坏死，反复激活肝星状细胞，最终导致肝纤维化的形成。

柔肝化纤颗粒是王振常教授在全国名老中医林沛湘治疗慢性肝炎、肝硬化的有效验方壮肝逐瘀煎及关幼波治疗慢性肝炎、肝纤维化有效经验基础上经模糊教学优化而来。前期研究[2-3]已证实其具有改善肝功能、提高HBV-DNA转阴率、降低肝纤四项水平、抗肝纤维化的作用。因此，本课题组以柔肝化纤颗粒联合恩替卡韦治疗乙肝后肝纤维化，观察临床疗效；通过观察血清中的炎症因子及T淋巴细胞亚群水平，并与同期单纯西医常规治疗的患者进行比较，探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 符合中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会颁布的《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版)》[4]及中国中西医结合学会肝病专业委员会颁布的《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[5]中的临床诊断标准：（1）血清HBs-Ag阳性,HBe-Ag阳性,HBV-DNA阳性；（2）ALT持续或反复异常；（3）肝纤四项中至少2项异常；（4）瞬时弹性成像检测肝脏硬度值为肝纤维化F2期、F3期患者；（5）腹部B超检查诊断由两名副主任及以上级别B超医师判定：肝内回声增粗，血管走向欠清晰等。

1.1.2 中医诊断标准 参考《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[5]“胁痛-肝肾阴虚证”诊断要求。主症：胁肋隐痛，腰膝酸软，五心烦热；次症：头昏目眩，两目干涩，失眠多梦；舌脉：舌质红，苔少或无；脉弦细数。确诊要求：具备3项主症或2项主症伴随1项次症，同时结合舌脉，由两名副主任及以上级别中医医师判定。

1.2 纳入标准（1）符合上述西医诊断及中医诊断的患者；（2）性别不限，病史完整，年龄20～70周岁；（3）肝纤维化分期为F2或F3期；（4）未经过任何抗病毒、抗肝纤维化药物或免疫抑制剂治疗，或既往接受过抗病毒药物治疗，但经过4周的洗脱期；（5）入组患者均符合慢性HBV感染抗病毒治疗适应症；（6）知情同意，签署知情同意书。

1.3 排除标准肝纤维化分期处于F1、F4期水平；既往有严重慢性疾病或合并心、肝、肾及精神病患者；曾经接受过恩替卡韦治疗，或接受过其他抗病毒治疗未经过4周的洗脱期的患者；排除对本次实验药物过敏的患者；怀孕及备孕的妇女。

1.4 研究对象本研究符合《赫尔辛基宣言》和《涉及人的生物医学研究国际伦理准则》的相关规定。选取2018年6月至2019年1月在广西国际壮医医院脾胃肝病科确诊为乙肝后肝纤维化患者90例，按随机数字表法分为治疗组与对照组，各45例。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 口服恩替卡韦分散片（正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20100019，0.5 mg/片），空腹服用，1次/d，0.5 mg/次。连续治疗12周。

1.5.2 治疗组 在对照组基础上口服柔肝化纤颗粒（黄芪15 g，薏苡仁15 g，黄精30 g，枸杞子30 g，大枣20 g，牡蛎20 g，鳖甲15 g，泽兰20 g，鸡内金10 g，橘红10 g，虎杖20 g，牡丹皮20 g），方中所有药物由广西中医药大学第一附属医院制剂室制备成颗粒，并由药剂科黄敏主任鉴定为正品，每日早晚两次，开水200 mL冲服，饭后2 h温服。连续治疗12周。

1.6 观察指标采集患者晨起空腹外周血3 mL，离心取血清，置于-70℃冰箱中冻存待测，于治疗前、治疗结束后各检测一次。严格按说明书进行操作。

1.6.1 肝功能 采用PUZS-300X全自动生化分析仪（北京普朗新技术有限公司）检测ALT、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）含量。

1.6.2 血清肝纤四项 采用AutoLumo A1000全自动化学发光免疫分析仪（安图生物工程股份有限公司）检测肝纤四项[透明质酸（HA）,IV型胶原（Ⅳ-C）、层黏蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）]水平。

1.6.3 肝脏硬度值（LSM）、血清炎症因子及HBV-DNA按照文献[6]采用JX54700024肝脏瞬时弹性扫描仪（FibroScan,FS）（法国Echosens公司）检测入组患者LSM，用kPa表示。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α)、白介素-6（IL-6）水平。全自动定量PCR仪（北京乐普医疗科技有限公司）检测血清乙肝病毒DNA（HBV-DNA）水平。HBV-DNA≤1×102IU/mL为阴性。

1.6.4 中医证候积分 参考《中药新药研究临床指导原则》[7]中的“胁痛-肝肾阴虚证”的相关证候诊断标准及中医症状疗效评定标准，选择主症胁肋隐痛、腰膝酸软、手足心低热和次症头昏目眩、两目干涩、失眠多梦的轻重分级量表。症状按照严重程度分为无、轻度、中度、重度4个级别，主症分别记为“0”“2”“4”“6”分，次症分别记为“0”“1”“2”“3”分。

1.6.5 外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞 参考文献[8]中T淋巴细胞检测方法，采用广西国际壮医医院检验科流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞百分百水平。操作严格按说明书进行。

1.7 疗效标准参考《中药新药研究临床指导原则》[7]中的疗效评定标准。临床痊愈：临床症状及体征均消失，中医疗效指数≥95%；显效：临床症状及体征基本消失，中医疗效指数≥70%且＜95%；有效：临床症状及体征均明显减轻，中医疗效指数≥30%且＜75%；无效：临床症状及体征均无明显改善，甚至加重，中医疗效指数＜30%。疗效指数（N）=[（治疗前症状积分-治疗后症状积分）/治疗前症状积分]×100%。总有效率=[（临床痊愈+显效+有效）例数/总例数]×100%。

1.8 安全性评价观察两组患者用药期间的血、尿及粪便常规，肝肾功能、心电图及胃肠道反应（上腹痛、恶心呕吐、反酸等）情况。

1.9 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料采用“均值±标准差”（±s）表示，组间比较采用成组t检验，组内治疗前后比较采用配对t检验；计数资料采用例和率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料两组患者均按时完成整个疗程，无失访与脱落病例。治疗组男21例，女24例；年龄31～64（46.7±7.2）岁；肝纤维化分期F2期20例，F3期25例。对照组男22例，女23例；年龄30～68（46.6±5.5）岁；肝纤维化F2期24例，F3期21例。两组患者人口学资料及临床特征比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 两组患者肝功能比较两组患者治疗后，AST、ALT均较治疗前降低，ALB均较治疗前升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组患者治疗后AST、ALT低于对照组，ALB高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表1）

表1 两组患者肝功能比较（±s）

表1 两组患者肝功能比较（±s）

注：与治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

组别 例数 时间 ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L）治疗组45治疗前49.20±17.71 51.78±16.37 35.51±3.31治疗后31.49±12.16ab 30.44±11.28ab 41.23±3.98ab对照组45治疗前48.78±18.10 47.91±15.86 35.62±3.60治疗后38.01±14.33a 35.35±12.41a 38.35±3.90a

2.2 两组患者血清肝纤四项比较两组患者治疗后血清肝纤四项均较治疗前降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组患者治疗后血清肝纤四项均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表2）

表2 两组患者血清肝纤四项比较（±s，ng/mL）

表2 两组患者血清肝纤四项比较（±s，ng/mL）

注：与治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

组别 例数 时间 HA Ⅳ-C LN PC-Ⅲ治疗组45治疗前182.67±72.79 125.01±37.43 115.53±27.56 137.03±48.01治疗后101.49±25.81ab 75.51±11.31ab 74.54±13.79ab 95.54±35.47ab对照组45治疗前177.44±65.95 132.67±40.07 112.12±26.19 145.02±51.90治疗后133.41±33.83a 92.77±17.60a 85.21±15.92a 104.53±30.05a

2.3 两组患者血清HBV-DNA、炎症因子水平及LSM值比较两组患者治疗后，血清HBV-DNA、炎症因子水平及LSM值均较治疗前降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组患者治疗后血清炎症因子水平及LSM值低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），血清HBV-DNA与对照组比较，差异无统计学差异（P＞0.05）。（见表3）

表3 两组患者血清HBV-DNA、炎症因子水平及LSM值比较（±s）

表3 两组患者血清HBV-DNA、炎症因子水平及LSM值比较（±s）

注：与治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

组别 例数 时间HBV-DNA（IU/mL）TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）LSM（kPa）治疗组45治疗前（4.97±0.70）×104 102.23±20.48 13.21±2.78 8.99±1.42治疗后 ＜1×102 a 85.96±18.34a b 8.56±2.67a b 6.72±0.41a b对照组45治疗前（5.22±0.43）×104 104.06±22.43 13.52±3.93 8.90±1.41治疗后 ＜1×102 a 90.39±20.57a 10.92±3.79a 7.31±0.21a

2.4 两组患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞比较两组患者治疗后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T细胞均较治疗前升高，CD8+T细胞较治疗前降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗组患者治疗后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T细胞高于对照组，CD8+T细胞低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CD4+/CD8+T细胞与对照组对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 两组患者T淋巴细胞亚群比较（±s，%）

表4 两组患者T淋巴细胞亚群比较（±s，%）

注：与治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

组别 例数 时间 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+治疗组45治疗前32.74±4.16 34.76±5.23 33.27±6.97 1.42±0.47治疗后40.31±5.98a b 38.37±3.03a b 23.91±4.28a b 1.61±0.66a对照组45治疗前33.86±3.11 33.61±6.20 36.01±6.63 1.52±0.41治疗后37.36±5.34a 36.43±4.16a 25.32±4.67a 1.84±0.69a

2.5 两组患者中医证候积分比较两组患者治疗后中医证候积分均较治疗前降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组患者治疗后中医证候积分均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表5）

表5 两组患者中医证候积分比较（±s，分）

表5 两组患者中医证候积分比较（±s，分）

注：与治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

主要症状 次要症状胁肋隐痛 腰膝酸软 五心烦热 头昏目眩 两目干涩 失眠多梦治疗组 45 治疗前 3.37±1.53 2.44±1.71 2.27±1.35 0.89±0.44 1.76±0.71 1.62±0.83 12.98±4.77治疗后2.22±1.02a b 1.21±1.88a b 1.12±0.46a b 0.60±0.19a b 1.06±0.51a b 0.50±0.48a b 6.41±4.44a b对照组 45治疗前2.61±2.03 2.53±1.47 1.92±1.53 0.97±0.35 1.89±0.50 1.61±0.93 12.58±5.55治疗后2.25±1.83a 1.38±0.59a 1.47±0.97a 0.71±0.20a 1.45±0.38a 0.78±0.43a 8.06±4.42a组别 例数 时间 总积分

2.6 两组患者临床疗效比较治疗组总有效率为88.9%（40/45），对照组总有效率为66.7%（30/45），差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见表6）

表6 两组患者治疗后临床疗效比较[例（%）]

2.7 安全性评价两组患者在治疗过程血常规、尿常规、肝肾功能及心电图等均未出现异常，患者无上腹痛、恶心呕吐、反酸等胃肠道反应。

3 讨 论

炎症贯穿着肝纤维化发展的始终，而迄今为止控制肝脏炎症被公认为是逆转肝纤维化的重要措施[9]。肝脏是人体最大的一个免疫器官，各种损肝因素影响肝脏免疫细胞的正常功能及表型，从而改变肝脏局部免疫微环境导致肝纤维化的发生。这与中医学认为正气不足（机体免疫功能）是导致肝纤维化的重要因素，各种湿热疫毒（炎症因子）是诱发肝损的病机相一致。研究证实，HBV病毒感染、免疫复合物及内毒素等均能刺激单核-巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6。TNF-α及IL-6是一种能促进肝内炎症反应的细胞因子，介导肝细胞持续受损，导致肝脏纤维化。T淋巴细胞亚群数量上的协调及免疫功能的下降是乙肝慢性化的关键因素。研究发现，慢性病毒性肝炎患者机体会出现免疫功能失调。HBV病毒感染中CD4+细胞能直接作用于感染的肝细胞，释放促炎细胞因子，促进肝纤维化的进展。在慢性肝炎患者中，当HBV特异的CD8+细胞应答不能抑制病毒复制时，通过募集T细胞而致肝脏炎症，直接引起肝脏病变，导致慢性肝炎的进展。

中医学根据肝纤维化的临床表现，将其归于“胁痛”之范畴。肝纤维化的病因病机复杂，但总的可归属于机体正气不足，情志失调、饮食不节、湿热疫毒及痰瘀凝结肝经脉络，出现肝疏泄调达受阻，脾胃升降失调，湿热疫毒凝结，导致肝纤维化的发生。病位在肝脾，日久及肾。王振常认为，肝藏血、肾藏精，精血互生，生理病理上相互影响，这与“精血（肝肾）同源”的中医理论相一致[2～3]。姚希贤等[10]认为，肝肾同源，肝病日久伤及肾脏，肾精消耗，出现肝肾阴阳俱虚，而慢性肝炎后期的肝纤维化患者多以肝肾阴虚证为主，多表现为心烦、口干咽燥、手足低热、两颧微红、舌质红绛无苔少津、脉弦细等症。

柔肝化纤颗粒由黄芪、薏苡仁、黄精、枸杞子、大枣、牡蛎、鳖甲、泽兰、鸡内金、橘红、虎杖、牡丹皮组成。方中黄芪味甘，归脾经，具有补气升阳、生津养血之功。黄精味甘，归脾肾经，有健脾益肾之功，《本草纲目》记载：“黄精补五劳七伤……填精髓。”枸杞子味甘，归肝肾经，有滋补肝肾之功，《药性论》言枸杞子“补益精诸不足”。三药合用能补肾柔肝，使肝体濡润而质补刚，且黄芪能补益正气，驱邪外出，正如“正气存内，邪不可干”理论一致。牡蛎、鳖甲味咸，归肝、肾经，均有滋阴潜阳、软坚散结之功，二药合用能滋肝阴、补肾水。薏苡仁、橘红、鸡内金皆归脾经，具有健脾之功。大枣味甘，归脾、胃、肾经，具有补中益气、养血之功。薏苡仁、橘红、鸡内金、大枣四药合用能健脾益气化痰。泽兰能活血化瘀使瘀除则肝经脉络通，气血正常运行。虎杖归肝经，有清热解毒之功，清热以解邪毒。诸药合用，以“补肾柔肝”为主，兼顾活血化瘀、健脾化痰、清热解毒、软坚散结之功。研究[11]显示此方通过提高HBVDNA转阴率，改善肝功能，延缓肝纤维化的进展。

结果显示，治疗组患者治疗后血清AST、ALT、LSM、HBVDNA转阴率及肝纤四项水平均较对照组显著下降，其中ALB水平较治疗前升高，提高柔肝化纤颗粒能有效改善肝功能及肝纤维化程度，且无不良反应发生。治疗组患者治疗后血清炎症因子IL-6、TNF-α低于对照组，外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T细胞明显高于治疗前，CD8+T细胞显著低于治疗前。提示柔肝化纤颗粒能有效抑制肝脏炎症反应，调节机体免疫功能。虽然其具体机制尚不明确，但现代药理学研究表明，黄芪多糖能有效提高机体巨噬细胞活性，改善T细胞等免疫细胞功能，增强机体免疫力，促进疾病恢复[12-13]。薏苡仁水提液能显著增加模型动物白细胞数量，增加T淋巴细胞酯酶阳性百分率，可推测其免疫增强作用可能是其抗肿瘤、抗炎等的作用机理之一[14]。黄精能调节老鼠CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平，提高细胞免疫能力[15]。枸杞子、鳖甲、牡丹皮、大枣具有保肝、抗炎、抗肿瘤及激活机体免疫系统等多种药理作用。大枣多糖是一种天然抗炎药，能调节人体血清蛋白水平，显著抑制IL-6等促炎因子，具有调节机体免疫力，抗炎等作用[16]。许丹等[17]发现牡蛎酶解产物可恢复CTX所致T淋巴细胞比例失调及细胞因子紊乱，增强机体免疫功能。MURATA T等[18]发现泽兰半乳糖能提高机体免疫力。鸡内金能增强大鼠淋巴细胞转化能力，改善其细胞免疫功能。橘红多糖有增强免疫、抗炎的作用[19]。虎杖皮通过抑制p38信号通路，阻断促炎基因来减轻肝损程度[20]。这体现了柔肝化纤颗粒在抗肝纤维化方面具有在多靶点、多位点、多途径的优点。本研究结果和以上研究结果具有一致性，说明中西医结合治疗更具优势。

综上所述，本文从中医学理论、临床实验等多个层面证实联合柔肝化纤颗粒治疗乙肝肝纤维化临床疗效显著，值得临床推广和深入研究。但导致肝纤维化发生的机制复杂，单从某一角度或层面出发并不能有效证实中药复方抗肝纤维化的治疗效果，今后若从肝纤维化的免疫机理和免疫稳态角度出发寻找疗效监测指标，联合临床及基础两方面的研究来揭示中药抗肝纤维化的机制，将对临床疗效的进一步提高起到积极推动作用。