益肾养卵方对早发性卵巢功能不全患者卵巢储备功能、卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax的表达及PI3K/AKT信号通路的影响*

张 慧，李雯雯，张建涛

（1.北京航空总医院，北京 100022；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

卵巢功能会随着女性年龄增大不断衰退，通常女性月经停止年龄在50.7岁左右[1]，但部分女性在40岁之前出现继发性闭经，伴低雌激素、促性腺激素升高等，即早发性卵巢功能不全（POI）[2]。POI发生率为1%～5%，且近年来呈现出低龄化的趋势[3]。当前，POI的致病机制尚不明确，现代医学认为其与医源性损伤、免疫、遗传等因素有密切关联[4]。越来越多研究指出：卵巢颗粒细胞自噬可能与POI的发生与进展有密切关联[5]。中医学认为其病机在于肾虚血瘀，以致邪盛正衰，久而促成POI[6]，与现代医学中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路介导卵巢颗粒细胞自噬引起POI有一定相关性。本次研究旨在观察益肾养卵方治疗POI疗效，并分析其对PI3K/AKT信号通路的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参考《早发性卵巢功能不全的临床诊疗中国专家共识》[7]与《妇产科学》[8]拟定POI临床诊断标准：（1）年龄＜40岁；（2）月经紊乱（闭经、月经稀发）超过4个月；（3）连续2次（间隔4～6周）血清促卵泡生成素（FSH）＞25 mIU/mL，雌激素波动性下降。

1.1.2 中医诊断标准 参考《中医妇科学》[9]拟定POI中医诊断标准。主症：月经提前或推后，量少色淡红（深红），或月经停闭。次症：腰膝酸软，形体消瘦，潮热盗汗，肢麻耳鸣，失眠健忘等，舌红，苔少，脉细缓。具备主症与至少2项次症，结合舌脉即可诊断。

1.2 纳入标准（1）年龄＜40岁的育龄期女性；（2）符合POI中西医诊断标准；（3）近3个月内未接受相关治疗；（4）同意参与本次研究，并签署知情同意书。

1.3 排除标准（1）输卵管不通、先天性性腺发育不全、生殖道畸形等器质性疾病者；（2）合并内分泌疾病或严重心肝肾原发性疾病者；（3）年龄≥40岁；（4）依从性较差，无法配合治疗者。

1.4 研究对象选取2019年1月至2020年3月在北京航空总医院中医门诊及妇科接受治疗的POI患者120例，采用随机数字表法将患者分为对照组与治疗组，每组60例。本次研究经北京航空总医院伦理委员会批准同意进行，研究过程遵守相关伦理学要求，伦理学审批号：201900152。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 患者于月经周期第5天起服用雌二醇地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷兰），批准文号：H20150345，规格：2 mg/片]进行治疗，1粒/次，1次/d，餐后0.5 h口服。停药后若未出现月经来潮，则在停药7 d后继续服药治疗，若月经来潮，则在第5天开始重复使用。

1.5.2 治疗组 在对照组基础上加用益肾养卵方治疗，方药组成：熟地黄20 g，鹿角胶、菟丝子、女贞子、山药、枸杞子各15 g，丹参、山萸肉、淫羊藿、覆盆子各10 g，陈皮、砂仁各6 g。1剂/d，加清水煎煮，取300 mL水煎液早晚分服。

两组均以3个月经周期记为1个疗程。

1.6 观察指标

1.6.1 中医证候积分 参考《中药新药临床研究指导原则（试行）》[10]并结合患者具体症状表现进行评分，主症按照症状严重程度无、轻度、中度、重度分别计0、2、4、6分，次症按照症状严重程度无、轻度、中度、重度分别计0、1、2、3分，评分越高提示症状越严重。

1.6.2 卵巢储备功能 患者月经周期第3～5天，清晨空腹抽取5 mL肘静脉血，室温下静置1～2 h，离心（3 000 r/min，15 min），取血清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清抗苗勒管激素（AMH）水平（试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，批号：ARB10908），化学发光免疫法检测血清FSH、雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）水平（上海沪震实业有限公司，FSH试剂盒批号：hz-H0760c，E2试剂盒批号：hz-0022c；LH试剂盒批号：hz-H0115c），并计算FSH/LH值；通过阴道超声检查测定卵巢直径，并计算卵巢总体积TOV（TOV=最大长宽高直径乘积×π/6）；测定窦卵细胞数量（AFC）。

1.6.3 卵巢颗粒细胞凋亡相关因子（Bcl-2/Bax）、PI3K/Akt信号通路表达水平 蛋白印迹法检测卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax与子宫前后壁PI3K/Akt信号通路表达水平，冰浴条件下加入细胞裂解液提取总蛋白并测定浓度。取50 μg蛋白上样，经SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离后转至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，4℃孵育过夜。一抗37℃孵育3 h，二抗37℃孵育1 h，采用Image Lab软件进行分析处理。

1.7 疗效标准参考《中药新药临床研究指导原则（试行）》[10]拟定POI疗效标准，痊愈：临床症状、体征均完全消失，经期正常，不孕者妊娠或疗效指数≥95%；显效：临床症状、体征显著改善，经期恢复（28±7）d，疗效指数≥70%，＜95%；有效：临床症状、体征减轻，经期、经量改善，疗效指数≥30%，＜70%；无效：未达到上述标准。疗效指数=[（治疗前中医证候积分-治疗后中医证候积分）/治疗前中医证候积分]×100%。

1.8 统计学方法研究数据采用SPSS 21.0统计学软件进行分析处理。疗效采用秩和检验；中医证候积分、卵巢储备功能指标、Bcl-2、Bax、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达等计量资料采用（±s）表示并进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料两组患者基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（见表1）

表1 两组患者基线资料比较（±s）

表1 两组患者基线资料比较（±s）

组别 例数 年龄（岁） 病程（年）Kupperman评分（分）对照组60 35.17±2.26 3.24±0.87 15.28±3.37治疗组60 35.21±2.35 3.18±0.79 15.32±3.64 t 0.095 0.395 0.062 P 0.924 0.693 0.950

2.2 两组患者疗效比较治疗组治疗总有效率88.33%（53/60）高于对照组的70.00%（42/60）。治疗组患者疗效显著优于对照组（P＜0.05）。（见表2）

表2 两组患者疗效比较[例（%）]

2.3 两组患者中医证候积分比较与治疗前比较，两组患者治疗后中医证候积分均显著降低（P＜0.05），且治疗后治疗组患者中医证候积分显著低于对照组（P＜0.05）。（见表3）

表3 两组患者中医证候积分比较（±s，分）

表3 两组患者中医证候积分比较（±s，分）

组别 例数 治疗前 治疗后 t P对照组 60 44.92±13.48 35.84±12.16 3.874 0.000治疗组 60 44.87±14.53 24.61±11.94 8.345 0.000 t 0.020 5.104 P 0.984 0.000

2.4 两组患者卵巢储备功能指标比较与治疗前比较，两组患者治疗后AMH、E2、AFC均显著升高（P＜0.05），FSH、LH、FSH/LH均显著下降（P＜0.05）；治疗后治疗组患者AMH高于对照组，FSH、FSH/LH均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；两组患者治疗前后TOV比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 两组患者卵巢储备功能指标比（±s）

表4 两组患者卵巢储备功能指标比（±s）

AMH（ng/mL） FSH（mIU/mL） E2（pmol/L） LH（mIU/mL）治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P对照组60 0.61±0.42 0.95±0.53 3.895 0.000 30.51±3.39 16.37±5.18 17.692 0.000 93.64±18.37 104.28±12.72 3.689 0.000 9.76±1.34 7.08±2.45 7.434 0.000治疗组60 0.58±0.39 1.14±0.48 7.014 0.000 30.67±3.58 13.27±4.94 22.092 0.000 91.86±22.53 107.35±14.81 4.450 0.000 9.83±1.47 6.46±2.21 9.835 0.000 t 0.405 2.058 0.251 3.355 0.474 1.218 0.273 1.456 P 0.686 0.042 0.802 0.001 0.636 0.226 0.786 0.148 AFC（个） TOV（cm3） FSH/LH治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P对照组60 2.78±1.2 3.94±2.03 3.802 0.000 5.54±3.62 6.18±2.94 1.063 0.290 3.12±0.18 2.27±0.29 19.290 0.000治疗组60 2.59±1.17 4.63±2.27 6.188 0.000 5.63±3.858 6.31±3.24 1.047 0.297 3.15±0.24 2.02±0.21 27.447 0.000 t 0.874 1.755 0.132 0.230 0.775 5.408 P 0.384 0.082 0.895 0.818 0.440 0.000组别 例数组别 例数

2.5 两组患者卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信号通路表达水平比较与治疗前比较，两组患者治疗后Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均显著升高（P＜0.05），Bax蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）；治疗后治疗组患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于对照组，Bax蛋白表达低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表5、图1）

表5 两组患者卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信号通路表达水平比较（±s）

表5 两组患者卵巢颗粒细胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信号通路表达水平比较（±s）

Bcl-2/β-actin Bax/β-actin治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P对照组60 0.33±0.12 0.51±0.22 5.538 0.000 0.64±0.17 0.53±0.24 2.897 0.004治疗组60 0.34±0.16 0.62±0.17 9.290 0.000 0.62±0.21 0.45±0.18 4.761 0.000 t 0.387 3.065 0.573 2.066 P 0.699 0.003 0.567 0.041 p-PI3K/β-actin p-Akt/β-actin治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P对照组60 0.43±0.06 0.52±0.09 6.445 0.000 0.44±0.05 0.48±0.08 3.284 0.001治疗组60 0.45±0.08 0.59±0.13 7.104 0.000 0.43±0.06 0.57±0.11 8.655 0.000 t 1.549 3.429 0.992 5.125 P 0.124 0.001 0.323 0.000 Bcl-2/Bax治疗前 治疗后 t P对照组60 0.52±0.03 0.95±0.06 49.652 0.000治疗组60 0.51±0.03 1.23±0.17 32.307 0.000 t 1.826 12.031 P 0.070 0.000组别 例数组别 例数组别 例数

图1 两组患者子宫内膜p-PI3K/p-AKT蛋白表达电泳条带图

3 讨 论

自噬是真核细胞特有的自我降解机制，即通过溶酶体途径降解受损的细胞器或长寿命蛋白质，是细胞维持稳态必须的机制。一般情况下，自噬维持在正常水平以保持内环境稳态，但氧化应激、炎症反应等不良刺激均可引起自噬水平的变化，自噬水平异常上调可引起细胞凋亡，卵巢颗粒细胞自噬导致卵泡细胞过早过快锁闭可能是引起POI的主要原因之一[11]。自噬是由相关信号通路与自噬基因调控的，其中PI3K/AKT信号通路与卵巢颗粒细胞自噬关系最为密切。PI3K是由调节亚基（p85）与催化亚基（p110）构成的异源二聚体，酪氨酸激酶受体可与p85相结合，同时解除对p110的抑制，使其与p85羧基端相结合，并促进二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转变为三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）激活Akt。之后Akt构象变化并磷酸化，p-Akt作用于下游凋亡相关蛋白并调节自噬水平[12]。Bcl-2、Bax是调节卵巢颗粒细胞凋亡的重要因子，二者互为拮抗作用，Bax蛋白表达水平上调，Bcl-2活性下降会促进细胞凋亡；反之Bcl-2蛋白表达水平上调，Bax活性下降则抑制细胞凋亡[13]。压力、缺氧、饥饿等应激状态会抑制Akt活化，继而诱导细胞自噬，引起细胞凋亡。白俊等[14]研究指出，卡铂可以通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢颗粒细胞自噬。王文静等[15]研究指出，补肾养精颗粒可以增加p-PI3K、p-Akt蛋白表达，上调下游Bcl-2蛋白表达水平并抑制Bax表达，从而抑制卵泡颗粒细胞凋亡。可见PI3K/AKT信号通路与卵泡锁闭有密切关联。

自噬参与了细胞增殖、分化、能量调节等诸多生理过程，过度自噬降解细胞生存所必须的成分并诱导细胞凋亡，与中医学中“邪之所凑，其气必虚”理念大致相同[6]。疾病可以看做是机体邪气与正气斗争的过程，通常情况下机体处于阴阳平衡状态，应激状态下机体正气不足，PI3K/AKT通路受到抑制，无法调控卵巢颗粒细胞自噬过程，继而引起卵泡锁闭，引发POI。POI在中医学中属于“不孕症”“闭经”“月经过少”等范畴。《温热逢源》云：“邪之初受，盖以肾气先虚，故邪乃凑之而伏于少阴”，指出了肾精充盛对抵抗外邪入侵的重要作用。《妇人归》云：“妇人所重在血……胎孕乃成”，说明气血条畅、肾精充盛是胎孕顺利的根本。《景岳全书》云：“肾乃精血之海”，肾藏精，主生殖。若肾气虚亏，则生殖之精无所养，女性无法正常排卵，则月经失调。故治疗POI需补肾益冲，经水自通，胎孕乃成。黎慧[16]研究指出，自拟排卵汤联合炔雌醇环丙孕酮片可以调控PI3K/AKT信号通路，调节患者激素水平，促使排卵恢复。李凤英等[17]指出，温肾助阳调周法可以通过调控PI3K/AKT信号通路，改善患者性激素水平，促进卵巢功能恢复。上述研究均证实补肾中药可调节PI3K/AKT信号通路，从而改善患者卵巢功能。本研究选用的益肾养卵方由左归丸化裁而成，方中熟地黄滋阴补血，鹿角胶益精养血，菟丝子滋补肝肾，女贞子补益肾阴，山药补中益气，枸杞子滋补肝肾，山茱萸补肾益气，淫羊藿补肾壮阳，覆盆子固精补肾。女性易因疾病而紧张焦虑以致气血不通，故佐以丹参清热活血，陈皮燥湿化痰，砂仁行气调中。全方滋补肾阴，温补肾阳，同时通调气血，健脾养肝。现代药理学研究指出，鹿角胶可改善微循环，调节性激素水平；覆盆子可促进排卵；熟地黄可促进卵泡成熟；山茱萸有助于调节性激素分泌。综上，本方可调节月经周期，改善卵巢功能。

当前，AMH、FSH、AFC、E2、TOV是临床上评估卵巢储备功能的重要指标。其中，血清AMH水平不随月经周期发生波动，具有一定的稳定性，此外血清AMH能够反映卵泡发育成窦状卵泡的水平。观察AMH即可判断卵巢内是否存有卵泡，是评估卵泡数量的唯一潜在标志，也是反映卵巢储备功能的理想指标[18]。AFC是指卵巢内直径2～9 mm的小卵泡，其与女性卵巢储备功能呈正相关性。FSH/LH是反映卵巢功能的重要指标，FSH/LH＞2～3.6提示卵巢储备功能不良[19]。本研究结果表明，与治疗前比较，两组患者治疗后卵巢储备功能指标AMH、E2、AFC均显著升高（P＜0.05），FSH、LH、FSH/LH均显著下降（P＜0.05），提示两种治疗方法均能改善POI患者卵巢储备功能。治疗后，治疗组患者AMH高于对照组（P＜0.05），FSH、FSH/LH低于对照组（P＜0.05），结合两组患者临床疗效与中医证候积分提示益肾养卵方治疗POI效果更佳。益肾养卵方治疗POI的主要作用机制在于调控PI3K/AKT信号通路，并调节Bcl-2/Bax的比值，该比值越大，说明抗凋亡能力越强[20]。治疗后，两组患者p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），提示PI3K/AKT信号通路被激活，并调控下游Bcl-2、Bax蛋白表达。治疗后两组患者Bcl-2、Bcl-2/Bax均显著升高（P＜0.05），Bax蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05），且治疗组患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于对照组（P＜0.05），Bax蛋白表达低于对照组（P＜0.05），提示益肾养卵方可以通过调节PI3K/AKT信号通路，抑制卵巢颗粒细胞过度自噬，减少细胞凋亡，从而改善POI患者疾病症状，提高卵巢储备功能。

综上所述，益肾养卵方可以调节PI3K/AKT信号通路，上调Bcl-2并抑制Bax蛋白表达，避免卵巢颗粒细胞过度自噬，从而减少卵巢颗粒细胞凋亡，提高患者卵巢储备功能。