无机元素指纹图谱结合化学计量学对甘草元素富集规律及产地溯源的研究*

于喆源，韦志超，王昭国，王 继，杨玺文

（张掖市质量检验检测研究院，甘肃 张掖 734000）

甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）作为应用最广泛的传统食药同源植物之一，为豆科（Leguminosae）甘草属甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎，具有解毒镇痛、祛痰止咳、调和百药的功效[1-2]。研究表明，无机元素通过与人体内有机物形成配位键，承担多种生物功能；同时在体外还可以与其他分子结合，产生协调增效作用[3]。所以，通过考察甘草中元素含量，可以明显地区分产地、基源、是否经过炮制等信息，从而更加全面地对甘草进行质量评价。指纹图谱是近年来用于表征天然植物中多成分特征的一种综合性质量分析方法，可以较为全面地反映出天然植物多成分体系的整体状况[4-5]，同时在产地溯源等非直接质量评价方面具有非常重要的意义[6-8]。一般指纹图谱常用于天然植物内有机活性成分的分析，对甘草中元素进行指纹图谱分析结合化学计量学进行品质评价的报道相对较少。因此，本实验采用电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）[9-10]，以27种无机元素的稳定同位素含量为指标建立无机元素指纹图谱，并采用化学计量学手段对指纹图谱信息进行化学模式识别研究，以期找到甘草内无机元素的累积规律，为更加合理地对甘草整体元素富集情况评价和产地溯源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料硝酸（优级纯，成都市科隆化学品有限公司），纯化水，元素标准溶液信息见表1。

表1 元素标准溶液信息

本实验药材采集自甘肃张掖各县区不同生长区域，经张掖市质量检验检测研究院药品检验中心杨玺文工程师鉴定为豆科甘草属甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）根茎，采集后阴凉处自然晾干，放入自封袋保存备用。样品信息见表2。

表2 14批甘草药材来源信息

1.2 仪器及设备电感耦合等离子质谱仪（ICP 2030，日本岛津公司）；超纯水机（Q-GardA2，默克密理博公司）；万分之一电子天平（GL224i-1SCN，赛多利斯公司）；微波消解仪（Mars6，美国CEM公司）。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备 精密称取约0.4 g甘草样品粉末于聚四氟乙烯消解罐中，加入浓硝酸5 mL，轻轻振荡后混匀置微波消解仪内，按照表3消解程序升温消解，消解完成后，冷却至室温，加少量纯化水润洗并转移至50 mL量瓶中定容，得待测溶液。标准物质和空白对照采用同样方式消解处理。

表3 微波消解程序

1.3.2 标准溶液的制备 将元素标准溶液用2% HNO3配制成相应的标准工作液。其中Ag、As、Au、Ce、Co、Cs、I、La、Mo、Ni、Pd、Se、Sn、Te、Ti、W、Y元素浓度梯度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L；Ba、Cu、Fe、Sr、Zn元素浓度梯度为0、1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/L；Pb元 素浓度梯度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/L；Al、Mn元素浓度梯度为0、1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200.0 μg/L；Cr、V元素浓度梯度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/L。

1.3.3 仪器参数设置ICP-MS参数设置：射频功率为1 200 W，等离子体氩气体积流量8 L/min，辅助气体积流量1.1 L/min，载气体积流量0.7 L/min，采样深度5 mm，池气体6 mL/min，池电压-21 V，能量过滤器7.0 V；仪器调谐主要技术指标：常规分析灵敏度指标115 In＞40 000 cps；方法选择：碰撞模式，池气体6 mL/min，池电压-21 V，能量过滤器7.0 V；内标溶液Bi、Ge、Sc、Rh、Re、In用于监测基质效应，同时在线加入，进行内标法定量。每个样品重复测定3次，取平均值。

1.3.4 标准曲线的绘制 根据试样中27种无机元素含量，配制系列质量浓度标准溶液，在优化的实验条件下采集标准溶液，以各元素质量浓度为纵坐标（X），内标校正后的峰强度为横坐标（Y），绘制标准曲线，得各元素对照品的回归方程。（见表4）

表4 各元素回归方程，相关系数和线性范围

1.3.5 方法验证 取1号甘草药材的消化后定容溶液，连续进样3次，考察其目标待测元素含量，RSD均小于5%；3水平加标回收试验，回收率均在80%以上，符合指纹图谱要求[11]。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的建立及相似度分析由于甘草的各无机元素含量差异极大，直接比对会造成不便。为便于无机元素指纹图谱绘制和比较研究，故对得到各元素含量缩放至同一数量级后，以元素种类为横坐标，相对含量为纵坐标绘制指纹图谱。（见图1）可以看出，不同批次的甘草药材在元素含量上有一定差异，但是曲线趋势大致相同，这种趋势特征可作为甘草的产地特征。指纹图谱相似度采用夹角余弦相似度进行表征，夹角越小，余弦值越接近于1，则越相似，结果见表5所示，表明样品甘草在元素富集特征存在比较明显的一致性，S14样品因生长年限为多年生，从图谱可以看出虽然元素组成及比例与其他样品相似，但相似度分析与其他样品还是具有明显的区别。

表5 龟龄集元素指纹图谱相似度分析

图1 甘草元素指纹图谱

2.2 化学计量学

2.2.1 聚类分析 运用IBM SPSS 19.0统计分析软件，以14批不同生长区域甘草的27个元素含量作为变量，采用组间连接聚类方法，以欧式距离平方为度量标准进行系统聚类分析[12]。从聚类结果来看，当分类距离d＝10～15时，14批不同生长区域的甘草可聚分为3类：编号为S2的为一类；S4、S12、S6的样品分别为一类；其余样品为一类。甘草元素具有较高的相似性，但可以看出采自甘肃省张掖市不同区域的甘草间依然存在差别，其中肃南裕固族自治县样品和其他采自张掖市的样品存在明显的差分，且当分类距离小于5时，可以看到不同县区存在联系，来自张掖市不同县区的样品存在差分；不同县区的绝大部分分为一类。14批甘草聚类分析树状图见图2。

图2 14批甘草样品聚类分析结果

2.2.2 主成分分析 以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据，将14批不同生长区域甘草样品的27个元素含量作为变量导入统计分析软件进行因子分析。结果，提取到5个主成分因子，其累积贡献率＞0.9，其中前3个累积方差贡献率为82.861%，表明前3个主成分因子即可以代表样品80%以上的信息；主成分因子1、2、3可作为甘草药材元素评价指标，适用于主成分分析。主成分因子的特征值和方差贡献率见表6。

表6 甘草药材元素主成分特征根和贡献率

将得到的成分矩阵进行正交旋转，得到27个指标在3个主成分中的旋转矩阵。结果显示见表7，27个元素对主成分均具有较明显的贡献率，其中Al、Co、Cr、La、Fe贡献率最大，对甘草整体元素水平的评价具有意义，同时这些贡献率大的元素对人体也具有明显的生物学意义，如：Fe参与人体造血和免疫，可影响神经系统[13-14]；Cr可影响糖脂代谢，要通过激活体内铬调素来协同或增强胰岛素功能而发挥作用[15]；Co以维生素B12和辅酶形式在人体内发挥重要生理作用[16-17]；Al、La则会对人体产生一定的不良影响[18-20]。

表7 旋转成分矩阵

续表7：

以W1、W2、W3代表3个主成分来作为14批甘草样品元素成分所表达的信息，以其27个元素含量标准化处理后值A为变量，进行向量运算，建立品质评价模型[9]。得到第一主成分的线性关系表达式为：W1=0.943A1+0.669A2+0.979A3+0.988A4+0.901A5+0.984A6+0.989A7+0.836A8-0.573A9+0.715A10+0.955A11+0.773A12-0.225A13+0.978A14+0.256A15+0.036A16+0.339A17+0.715A18+0.599A19+0.264A20+0.903A21+0.600A22+0.986A23+0.967A24-0.039A25+0.0.547A26+0.880A27；第二主成分的线性关系表达式为：W2=-0.085A1+0.282A2-0.002A3-0.021A4-0.215A5-0.011A6-0.073A7-0.084A8+0.284A9-0.286A10+0.042A11+0.176A12+0.304A13+0.042A14+0.925A15+0.860A16+0.686A17-0.286A18-0.201A19+0.897A20-0.100A21-0.252A22-0.060A23-0.087A24+0.898A25-0.002A26+0.027A27；第三主成分的线性关系表达式为：W3=-0.267A1+0.455A2-0.136A3-0.028A4+0.114A5-0.108A6-0.090A7+0.055A8+0.598A9+0.359A10-0.220A11+0.517A12+0.775A13-0.082A14-0.118A15-0.342A16-0.182A17+0.359A18-0.403A19+0.194A20-0.296A21-0.424A22-0.076A23-0.149A24-0.327A25-0.165A26+0.141A27。将上述表达式与所对应的3个主成分的方差贡献率加权后，得到甘草质量综合评价函数的表达式为：W（综合）=（56.911%W1+16.003%W2+9.947%W3）/82.861%，综合得分越高表示药材样品的整体元素含量水平越高[9]。14批甘草样品主成分得分、综合得分及排名见表8。

表8 14批不同种植地点甘草元素主成分得分、综合得分及排名

结果显示，甘草生长中对于元素积累量与甘草的生长地域有比较明显的相关性，同时，和甘草的生长年限也有明显的相关性。评分第一的14号样品是野生多年生甘草，其根部直径约4 cm，明显区别于其他样品，这与化学计量学的统计结果基本一致。

2.2.3 偏最小二乘法判别分析 以14批甘草样品中27个共有无机元素稳定同位素含量为变量，进行OPLS-DA分析，结果见图3，与聚类分析结果一致，张掖市肃南裕固族自治县种植样品在左半区，其他采自张掖市的样品在右半区，且S2号多年生野生甘草也与其他样品显示出一定的差异性。通过VIP值筛选出甘草差异较为明显的的元素，结果见图4，以VIP值＞1为筛选标准，标记出13个贡献较大的元素，依次为Ba、Te、Al、Cs、Co、Ce、Fe、La、V、As、Mn、Cr、Y，即上述元素与甘草种植环境具有密切的关系。这与主成分分析得出的结论基本一致。

图3 14批甘草样品的OPLS-DA模型得分图

图4 14批甘草样品OPLS-DA模型中共有元素的VIP值

3 小 结

指纹图谱虽然无法确定被检测到的所有物质明确的化学组成，但对于天然植物样品质量控制具有积极的促进作用。

本试验对同一生态区域不同生长区域的甘草建立了无机元素稳定同位素指纹图谱。相似度评价结果显示，14批不同生长区域的甘草样品在元素种类上基本一致，但含量有一定差距，不同地域和生长时间尤其是多年生野生甘草其元素累计规律存在较为明显的区别。化学计量学主成分分析结果显示，Ba、Te、Al、Cs、Co、Ce、Fe、La、V、As、Mn、Cr、Y在特征主成分中具有较大贡献值。同时从分析结果看，虽然取样地点从生态学上属于同一生态区域，但其元素组成依然有明显的差异性，原因可能与种植地域土壤矿物质及水分等自然条件和肥料施用有关。但因工作条件有限，所采集样品批次与覆盖地域较为集中，样品本身的不均一性引起的误差被放大，部分结论并没有完全达到理想预期。但可以看出，通过无机元素稳定同位素指纹图谱结合化学计量学评价甘草元素富集规律，可以为天然甘草种植年限和种植地域溯源的判定提供一定依据，同时为进一步建立全面的质量评价体系提供一定基础。未来的工作中，将在此基础上，进一步扩大取样的范围，增加样品代表性，更加深入地进行试验。