基于网络药理学和分子对接技术探讨附子-白芍配伍治疗抑郁症的作用机制*

张景霞，李莎莎，李 凡，王卫锋，赵重博，李 芳

（1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

附子-白芍配伍具有温阳敛阴、养血缓急、调气机等作用，最早出现于《伤寒杂病论》[1]。附子（Aconiti carmichaeli Radix Praeparata）为毛茛科乌头属植物，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效，后世皆用其治疗危重症患者。现代研究表明附子主要化学成分有生物碱、多糖、神经酰胺等，具有强心、抗炎、镇痛、抗衰老、抗抑郁等药理作用[2-3]。白芍（Paeoniae Radix Alba）为毛茛科植物，具有养血敛阴、柔肝止痛的功效，化学成分有黄酮类、萜类化合物、多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁等药理作用，用于治疗神经退行性疾病[4]。刘磊[3]研究表明附子生物碱可通过上调cAMP反应元件结合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）-脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）通路达到抗抑郁作用，同时具有促进神经元再生的作用。白芍可使海马组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）的水平明显升高，并且使5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）的水平明显下降，达到抗抑郁的作用[5]，且其提取物及芍药苷均具有抗抑郁作用[6-7]。

抑郁症是一种慢性反复发作的脑疾病，临床表现为持续的情绪低落、焦虑、睡眠障碍、思维迟钝、兴趣减退、对前途悲观失望等，严重者甚至有自杀倾向[3]。随着社会的发展，人们在生活和工作中的压力越来越大，抑郁症发病率逐年上升，但其发病机制尚不明确[8]。中医认为抑郁症属于“郁病”，其发病机理是心神失养，体内肝气郁结，治疗抑郁症应以疏肝理气解郁为主[9]，还有少数医家认为应以消痰利胆为主[10]。目前有关中药治疗抑郁症的研究越来越多，但主要集中在单味药和单一作用机制等方面[11]，而传统中医药多是将药材配伍使用，中药成分复杂，治疗相关疾病具有多靶点的特征。本研究利用网络药理学和分子对接的方法，探讨附子-白芍配伍治疗抑郁症的分子靶点和机制，构建其治疗抑郁症的分子靶点网络，为中药复方治疗抑郁症的科学研究提供参考。

1 资料和方法

1.1 潜在活性成分及靶点筛选 检索数据库（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）得到附子和白芍的化合物成分，筛选条件设定为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，血脑屏障（BBB）≥-0.3[9]，筛选出附子和白芍的化学成分及相关靶标，并在Uniprot数据库（http//www.uniprot.org/）将筛选出的靶点蛋白标准化。

1.2 抑郁症靶点的获取 检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和Disgenet数据库（https://www.disgenet.org/）得到与抑郁症相关的所有靶点。

1.3 附子-白芍配伍靶点与疾病靶点集Venn分析 将附子-白芍配伍主要化学成分作用靶点与疾病靶点数据集进行Venn 分析（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出附子-白芍化学活性成分与抑郁症的靶向关系。

1.4 网络建立与富集分析

1.4.1 蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）网络图 将得到的交集靶点在线导入String数据库，物种设为“Homosapiens”，阈值设为中等置信度“medium confidence=0.4”，其余参数保持默认设置不变，得到蛋白与蛋白间相互作用信息，构建PPI网络图，利用“Network analysis”功能进行网络的拓扑属性分析，根据其节点度值Degree参数，明确靶点和靶点间作用关系；进而根据网络拓扑学理论得知其在网络中信息传递效率更高，能影响更多节点。

1.4.2 生物过程注释及代谢通路分析 为了阐述附子-白芍配伍与疾病相关成分的靶点在生物过程中的功能作用机制，以R Studio软件对交集靶点进行KEGG代谢通路分析和GO生物信息学富集，描述基因靶点的分子功能（MF）、所处的细胞位置（CC）和参与的生物过程（BP）；用KEGG数据库富集靶点基因参与的主要生化代谢途径，以P<0.05为显著性差异作为判定值，对富集结果进行可视化处理，以说明附子-白芍配伍抗抑郁活性成分及参与生物途径之间的关系，并阐明附子-白芍配伍多成分、多靶点、多途径协同抗抑郁症可能的作用机制。

1.5 分子对接分析 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到药材中活性化合物的3D结构；从RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库中筛选得到的核心靶蛋白的晶体结构，去除了水分子和配体小分子，分离出潜在蛋白的结构。在Discovery Studio 2016软件中采用LibDock程序进行对接，对接空腔和大小根据化合物及蛋白质分子进行设定，其余参数保持默认，对化合物和靶标蛋白进行分子对接分析。

2 结果与分析

2.1 有效成分的搜集与筛选 根据DB、DL、BBB值筛选得到10个潜在活性成分，其中附子潜在活性成分7个，根据GeneCards和Disgenet数据库中抑郁潜在的靶点和附子-白芍相关靶点的映射反推配伍后可能存在的有效成分共6个，相应靶点蛋白46个，活性成分的OB、DL和BBB值见表1，所对应的结构见图1。

图1 附子-白芍中有效化合物的结构

表1 附子-白芍中化合物的OB、DL 和BBB

2.2 疾病及药物靶点的筛选 检索GeneCards和Disgenet数据库设定为“人类”，得到抑郁症相关的基因靶点共9 785个，与附子-白芍配伍潜在靶点进行匹配，通过Venny 2.1.0映射最终得到交集靶点36个。（见图2）

图2 “成分-靶点”及“疾病-靶点”Venn 图

2.3 PPI网络建立及富集分析

2.3.1 PPI网络 将36个交集基因名导入String数据库，导出TSV文本，再导入Cytoscape3.7.2软件得PPI网络图，共36个节点，100条边。CASP3与其他靶点的联系最多，其次是JUN、CHRM1、ESR1。CASP3参与Caspases的激活级联反应，负责细胞凋亡的执行。（见图3）

图3 36 个关键靶点PPI 网络图

2.3.2 富集分析 采用CludterProfiler程序包对36个交集靶点基因进行GO、KEGG功能注释和富集分析，GO富集分析中MF、CC和BP功能分析均设Pvalue Cutoff=0.05；Qvalue Cutoff=0.05并绘制条形图。KEGG通路富集分析设定Pvalue Cutoff=0.05，筛选排名前20的通路绘制气泡图。（见图4～5）

图4 附子-白芍治疗抑郁症活性靶点GO 富集分析

GO富集分析结果表明富集主要集中在生物过程上，共433条富集结果，其中膜电位调节、肌肉系统过程、血液循环调节和肌肉收缩过程参与的基因数目最多。细胞组分中有58条富集结果，其中基因参与最多的是突触后膜和膜筏，突触后膜面向神经末梢的突触前膜，由突触裂口与之分离，神经递质穿过突触间隙，将信号传递到突触后膜[12]；膜筏是不均匀的，高度动态的，富含固醇和鞘脂的膜结构域，将细胞分隔开[13]；分子功能中有71条富集结果，其中神经递质受体所占比重较大，它与神经递质结合并传递信号，改变细胞活动；研究表明，5-HT1A受体既是突触前膜自身受体又是突触后膜受体，这2种受体对5-HT系统具有相反作用，可调节其水平，发挥抗抑郁作用[8]。附子-白芍可通过调节机体的多种生物过程而发挥抗抑郁作用。

图5 KEGG 通路富集图

对36个靶基因进行KEGG通路富集分析，共得到67条富集结果，以P＜0.05，取排名前20的为候选信号通路，主要富集在神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触、γ-氨基丁酸能突触、PI3k-Akt信号通路及雌激素信号途径等信号通路。结果表明，附子-白芍能通过多条信号通路发挥抗抑郁作用。2.4 药材-成分-靶点-通路网络分析 利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能将“药材-成分”“成分-靶点”“靶点-通路”网络合并，得到“药材-成分-靶点-通路”网路图。网络中粉色节点表示药材，橙色节点表示有效成分，绿色节点表示与抑郁症的相关疾病靶点，红色节点表示与抑郁症靶点相关的通路。根据网络图分析得知，通路神经活性配体-受体相互作用和钙信号通路与潜在靶点存在较多的连接。此外，附子中的三角豆素和白芍中的β-谷甾醇对活性靶点SCN5A、PTGS2、ADRB2和ADRA1B均有调控作用；潜在活性靶点PTGS1和PGR连接较多的边数；说明附子-白芍配伍是以多途径、多环节、多靶标整体协同增效。（见图6）

图6 药材-成分-靶点-通路网络图

2.5 分子对接分析 根据“药材-成分-靶点-通路”网络图选取活性成分连接靶点数较多的化合物β-谷甾醇、三角豆素，并选择靶点PTGS1与上述2种化合物进行分子对接，且成分β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇均作用与PGR靶点，利用Discovery Studio 2016软件进行对接验证。Mairin能够与PGR靶点中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸残基结合，产生氢键和共轭效应，增加了结构的稳定性，配体受体结合得分较高。β-谷甾醇能够与LYS58、TYR63、PHE241等位点结合形成大量的氢键，表明亲和力较好。谷甾醇与TYR63、PRO235、TYR26等位点结合。PTGS1与三角豆素、β-谷甾醇分子对接得分为110.82和109.12，表明PTGS1与附子和白芍的成分具有良好的亲和力，这与“药物—成分-靶点-通路”网络分析结果一致，化学成分与活性位点的结合而发挥治疗效果。（见表2、图7～8）

图7 PGR 与Mairin、β-谷甾醇、谷甾醇分子结合图

表2 化合物与潜在靶点分子对接结合能量及得分

3 讨 论

图8 PTGS1 与三角豆素、β-谷甾醇分子结合图

本文采用网络药理学的手段，筛选得到附子-白芍化合物6个，预测治疗抑郁症的潜在靶蛋白36个。网络图提示附子-白芍治疗抑郁症的有效化合物为三角豆素、β-谷甾醇、谷甾醇和Mairin，有效靶点为PTGS1和PGR。PPI网络拓扑学分析结果显示，CASP3与其他靶点的联系最多，是细胞凋亡的主要执行者，激活下游信号调节因子促进细胞凋亡；GO富集结果显示附子-白芍配伍主要是通过参与膜电位调节、血液循环调节、对铵离子的反应、G蛋白偶联受体信号途径、胞浆钙离子浓度的调节、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号途径及钙离子输运等生物过程发挥抗抑郁作用。KEGG主要富集结果提示附子-白芍抗抑郁的靶点主要集中在神经活性配体和受体相互作用、钙信号通路、PI3K-Akt、γ-氨基丁酸能突触和5-羟色胺能突触等信号通路。同时，选取β-谷甾醇、三角豆素与活性靶点PTGS1对接，β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇与活性靶点PGR对接，模拟验证预测结果，结果显示化合物和靶点PTGS1及PGR有良好对接活性。研究结果说明附子-白芍配伍治疗抑郁症具有多成分、多靶点、多通路协同作用特点，并使用分子对接技术得到了初步验证。

β-谷甾醇和三角豆素与潜在靶点连接的度值较高，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、解热、免疫调节、止痛等作用[14]，能够显著提高脑内5-HT、NE和代谢产物5-HIAA，有研究表明β-谷甾醇抗抑郁活性是通过这些神经递质介导的[15]；三角豆素具有抗炎、抗菌、抗氧化及肝保护作用[16]。研究表明氧化应激与抑郁有较大的关系[17]。

中枢神经系统中5-HT活性降低是引发抑郁的基础，可通过5-羟色胺能突触信号通路来升高5-HT[18]；神经活性配体-受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合，可改善神经递质传导功能而发挥抗抑郁作用[19]；研究证明小鼠抑郁样行为的改善作用伴随着前额叶灰质和海马内的基因表达差异，而这些基因主要集中在神经活性配体和受体相互作用的信号通路上；γ-氨基丁酸是一类重要的抑制性神经递质，主要分布在脑内且含量较高，与焦虑、抑郁和失眠的发病机制有关[3]。PI3K-Akt信号通路中AKT可促进NF-κB蛋白表达，从而扰乱下丘脑-垂体-肾上腺轴功能使炎症反应失调，将加重抑郁症状[20]。

本研究预测了附子-白芍配伍治疗抑郁症生物过程及通路的可行性，表明了其多靶点、多通路的治疗特点，但对其关键生物过程和关键通路的调控还应进一步的深入研究，后续应进行体外细胞实验或体内动物实验等手段加以验证，以确保预测结果的科学性及准确性。