二维液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中的壬基酚

杨晋青，虞成华，翁史昱

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233）

0 引言

壬基酚（nonylphenol，NP）是一种能够干扰生物和人体激素合成、分泌、传递、结合以及消除等环节的环境类激素。相关实验已经证实NP 的雌激素效应和生物毒性[1-3]。由于壬基酚常作为塑料增塑剂使用，所以塑料食品包装材料中的壬基酚很容易迁移至食品中，给食品带来安全风险。壬基酚在刚开始发育的婴幼儿身上作用将更加明显，可能对婴幼儿的内分泌系统造成不可逆转的影响，使得婴幼儿性发育速度过快，免疫能力差[4-6]。

目前，检测壬基酚的方法有酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法等，检测对象包括包装材料、水、蛋、牛奶、奶粉、水产品等样品类型，研究方法也各有不同[7-14]。由于目前缺乏奶粉中壬基酚检测的国家标准，壬基酚的食品安全风险监测指定检验方法为BJS 201913《食品中辛基酚等5 种酚类物质的测定》，该方法前处理过程需要固相萃取柱净化、氮吹仪浓缩等步骤，容易造成本底值偏高或样品被污染的相关问题。基于多种分离机理的多维色谱技术由于其操作简单，前处理时间可大大缩短，已经越来越多的应用到食品分析中[15-16]。本研究将建立一种使用二维液相色谱-串联质谱法检测婴幼儿奶粉中壬基酚的方法，该方法具有操作简单高效、重复性好、灵敏度高等优点。能够准确的对奶粉中的壬基酚残留量进行检测，为奶粉产品风险监测提供有力技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：甲醇，乙腈，均为色谱纯；氨水（分析纯），水为符合GB/T 6682 规定的一级水（Milli-Q Synthesis超纯水系统制备）。

标准品：壬基酚（CAS号：25154-52-3）纯度≥99.0%；壬基酚-13C6（CAS 号：1173020-38-6；100 μg/mL溶于乙腈中），于-20 ℃保存。

1.2 仪器与设备

Thermo U3000 双三元高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；Thermo TSQ QUANTUM UL⁃TRA 三重四级杆串联质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；其他设备包括超声仪，上海鲸德公司；Vortex Ge⁃nius 3 型漩涡混合器，德国IKA 公司；离心机，德国Ep⁃pendorf公司。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备溶液的配制

准确称取10.0 mg的壬基酚标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制备成质量浓度为1 000 mg/L标准储备液。然后用乙腈稀释成质量浓度为1 mg/L的标准中间液；壬基酚-13C6则用乙腈稀释成质量浓度为1 mg/L的内标工作液。

1.3.2 标准工作溶液的配制

分别准确吸取适量标准中间液（1 mg/L），加入同位素内标工作液（1 mg/L），用乙腈稀释成质量浓度为0.5、1、5、10、20 μg/L和50 μg/L的标准工作溶液。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱条件

第一维色谱柱：Waters XBridge C8：2.1 mm× 30 mm，10 μm；第二维色谱柱：Agilent Eclipse plus C18：2.1 mm×100 mm，3.5 μm。A1 和B1 流动相对应泵1，A2 和B2 对应泵2，流动相A1 和A2 为甲醇，流动相B1 和B2 为水。泵1 的流速为2 mL/min，泵2 的流速为0.4 mL/min；柱温为35 ℃；进样量100 μL。泵1 和泵2 的梯度如表1 所示。

表1 二维液相梯度洗脱条件

1.4.2 质谱条件

离子源为ESI 源；扫描方式为负离子；鞘气流量为55 L/min；辅助气流量为15 L/min；喷雾电压为-3 500 V；毛细管温度为350 ℃；碰撞气为高纯氮气（≥99.999%）；离子传输管电压为73 V，数据采集模式为多反应监测（MRM）。定性定量离子对、碰撞能量等参数如表2 所示，壬基酚的多反应监测（MRM）色谱图结果如图1～2所示。

表2 壬基酚的质谱参数

图1 壬基酚标准品的MRM色谱图

图2 样品中壬基酚的MRM色谱图

1.4.3 液相色谱-串联质谱确证

定性测定：被测组分选择1 个母离子，2 个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5%之内；且样品中被测组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3 规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

定量测定：将壬基酚标准系列工作液注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液中壬基酚与其对应的13C 同位素标记物的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到壬基酚峰面积与对应的同位素内标物峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中壬基酚的浓度。

1.5 样品前处理方法

准确称取1 g（精确至0.001 g）样品于15 mL 具塞玻璃试管中，加入0.01 mL同位素内标工作液和10 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取15 min，置冰箱-20 ℃冷冻2 h，取出于8 000 r/min 离心5 min，取上清液过0.22 μm 滤膜后，用液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤同时进行空白实验。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

实验选用了Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）作为实验用柱，分别比较了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mmol/L 乙酸铵/乙腈这几种流动相对目标化合物离子化程度的影响，研究结果表明，采用水/甲醇作为流动相洗脱，获得了理想的峰形，质谱信号最强。其他流动相均会使信号降低，这可能是由于使用其他流动相时离子源中浓度过高会抑制壬基酚的电离，从而导致离子化效率下降的缘故。

2.2 二维色谱流路构建与切换时间的确定

二维液相色谱既要考虑2 个维度的体系兼容性，又要考虑这2 个维度存在一定的差异，本研究选用了Waters XBridge C8（2.1 mm× 30 mm，10 μm）作为第一色谱柱，Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）为第二色谱柱。在表1 液相条件下，壬基酚的分离度好，信号响应大，杂质干扰小，如图1 所示。由图1 可知壬基酚在第二维色谱柱的保留时间为4.98 min。因此将阀切换时间的设定在3.0 min之后。

二维液相色谱的具体连接方法如图3 所示。在0～3 min，六通阀处于1 和2 连通状态，如图3（a）。样品经自动进样器导入第一维色谱柱（在线净化柱），通过泵1 系统，流动相以一定流速淋洗第一维色谱柱，去除干扰基质，同时将样品富集在柱头处。与此同时，第二维色谱柱（分析柱）通过泵2 系统以初始流动相进行平衡；在3～4 min，六通阀处于1 和6 连通状态，如图3（b）。此时，第一维色谱柱与第二维色谱柱串联，通过泵2，流动相将富集在第一维色谱柱上的样品导入第二维色谱柱中进行分离分析；在4.0～10.0 min，六通阀处于1和2连通状态，如图3（a）。此时，第一维色谱柱与第二维色谱柱在各自的流动相条件下冲洗和平衡。

图3 二维液相色谱系统连接示意图

2.3 质谱条件的优化

壬基酚具有一定的弱极性或中等极性，选择电喷雾（ESI）离子源分别在正离子、负离子模式下进行母离子全扫描，对比两种模式，得出壬基酚负离子模式的离子峰强度比正离子峰强度高很多。而且其分子结构中含有酚羟基，因此选择负离子模式检测，首先进行一级母离子全扫描，确定其母离子，再用子离子扫描方式进行二级质谱扫描分析，选择丰度相对较高、质荷比较大的两个特征离子碎片分别作为定量离子和辅助定性离子。通过优化离子化电压、离子源温度、鞘气、辅助加热气、离子传输管电压、碰撞能量等质谱参数，使壬基酚的母离子与特征碎片子离子的离子对强度达到最大。结果表明：壬基酚在负离子化模式下易形成一级特征离子峰[M-H]-219.3（m/z）和很强的二级特征离子峰为133.1（m/z），具体的二级特征离子峰见图1。

2.4 样品前处理方法的确定

本文采用乙腈作为提取溶剂，主要是考虑到乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用，且带出的弱极性成分较少。超声时间是对结果影响较大的因素之一，对5，10，15，20 min 和30 min 不同超声时间进行了试验，试验结果见图4。结果表明超声15 min后，样品的回收率就能达到90%以上。

图4 不同超声时间对提取率的影响

2.5 空白试验的考察

为了尽量降低空白实验的本底含量，实验器皿尽量都采用玻璃制品，而且发现滤膜、注射器和进样小瓶等实验用品均对空白实验的本底支有很大影响，如图5 所示。故建议实验中使用到的所有有机溶剂和实验材料，在使用前，必须先考察空白实验的本底含量。

图5 空白样品中壬基酚的MRM色谱图

2.6 基质效应

质谱的基质效应是指样品中复杂的干扰物对分析物质谱响应的抑制或增强，可用基质标准曲线与标准曲线斜率的比值进行评估[17]。本工作通过对标准溶液和样品提取液中的内标的物质的峰面积进行评估，发现壬基酚在奶粉基质中的基质效应比值小于1，存在轻微的基质抑制效应，但可通过内标法对基质效应进行消除。

2.7 线性范围和检出限

根据仪器工作条件对标准溶液系列进行测定，以壬基酚的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积与内标物质峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，壬基酚的质量浓度在0.5～50 μg/L 内与其对应的峰面积与内标物质峰面积的比值呈线性关系，线性回归方程为y=4.938×10-2x+6.122×10-2，相关系数不小于0.999。以3倍信噪比计算方法的检出限（3S/N）为0.5 μg/kg，10倍信噪比计算方法的定量限（10S/N）为1.0 μg/kg。BJS 201913 方法的定量限为2.0 μg/kg，该方法可以满足日常婴幼儿奶粉中壬基酚的定量需求。

2.8 回收率和精密度试验

取经检验不含壬基酚的婴幼儿奶粉样品，分别按样品中1、2、10 μg/kg 含量水平添加一定量的壬基酚标准溶液，每一添加浓度重复6 份样品，按上述实验方法测定，计算其回收率和精密度。得到3 个添加水平下的回收率结果见表5。结果表明：在3 个添加水平下的加标回收率在85.4%～97.3%之间，相对标准偏差为2.08%～5.11%。

表5 壬基酚回收率及精密度（n=6）

2.9 方法比对

按照试验方法对6 种婴幼儿奶粉进行测定，同时和BJS 201913《食品中辛基酚等5 种酚类物质的测定》进行比较，比对结果见表6。由表6 可知：本方法和BJS 201913 方法相对偏差小于10%；并经F 检验双样本方差分析，当a=0.05 时，F=1.01，小于F 临界值5.05，说明两组数据无显著性差异。该方法可用于婴幼儿奶粉中壬基酚残留的快速检测。与BJS 201913 相比，本方法由于省去了前处理过程的固相萃取柱净化和浓缩步骤，节约了前处理时间，并且降低了本底值偏高或样品被污染的可能性。

表6 不同测定方法的结果比对

3 结论

本文建立了一种使用二维液相色谱-串联质谱法检测婴幼儿奶粉中壬基酚含量的检测方法，该方法在0.5～50 μg/L 质量浓度范围内具有良好的线性，线性相关系数r≥0.999；定量限为1.0 μg/kg；在3 个添加水平下的加标回收率在85.4%～97.3%之间，相对标准偏差为2.08%～5.11%。使用该方法对实际样品进行检测，证明该方法具有特异性强、前处理简单、准确性高、重复性好、灵敏度高等优点，适用于婴幼儿奶粉中壬基酚的测定。