Yes相关蛋白1对胃癌顺铂化疗敏感性的影响及作用机制初探

杨振 张红珠 张伟 付婷婷

济南市第七人民医院消化内科 250101

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其病死率高居肿瘤病死率的第2 位［1-2］。化疗是胃癌术后的主要治疗措施，而耐药性的产生直接关系化疗的成功。以顺铂为代表的化疗药物是胃癌化疗的一线药物，长期用药效果饱受耐药性及毒副作用影响［3］。文献指出，Yes 相关蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）在多种恶性肿瘤中的差异表达与细胞的增殖关系密切［4-5］。徐岗等［6］研究发现，干扰 YAP1 可增强食管癌对顺铂的化疗敏感性，提示YAP1可能在肿瘤耐药形成中发挥作用。前期研究结果显示，胃癌组织中YAP1蛋白表达明显高于癌旁正常组织。目前关于胃癌中YAP1 与化疗敏感性的研究尚未见报道，我们推测胃癌中YAP1蛋白的表达与顺铂敏感性相关。为验证该观点，2019 年1 月至2020 年12 月，本研究拟通过构建干扰胃癌细胞中YAP1 表达，探究YAP1对胃癌细胞顺铂敏感性的影响及作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 细胞 实验用人正常胃上皮黏膜细胞GES1 和人胃癌细胞SGC-7901 购于美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 主要试剂 RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）培养基、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；裂解液Trizol（美国Invitrogen 公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国Sigma公司）；实时荧光定量逆转录试剂盒、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（日本TaKaRa 公司）；鼠抗人β-actin 抗体、鼠抗人 YAP1 抗体、鼠抗人 IGF 抗体、鼠抗人Akt抗体、鼠抗人TGF-β抗体（美国Abcam公司）。

1.1.3 主要仪器 Ⅸ73 倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）；7500 Real-Time 定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific-CN 公司）；Spectra Max iD5 酶标仪（美国molecular devices 公司）；PE2400 电泳仪、GelDOC2000 型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代 人正常胃上皮黏膜细胞GES1 置于含10%胎牛血清RPMI1640 培养基中，人胃癌细胞SGC-7901 置于含10%胎牛血清DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中常规培养。待细胞铺满80%镜下视野时采用0.25%含乙二胺四乙酸四钠胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行功能实验。

1.2.2 慢病毒感染人胃癌细胞株 YAP1 沉默重组慢病毒颗粒Lv-shRNA-YAP1 及阴性对照慢病毒颗粒Lv-shRNA-NC均委托广州锐博生物技术有限公司构建。

取对数期生长细胞SGC-7901，离心后重悬调整浓度，按3.5×104个/孔接种于六孔板中，待细胞生长状态良好达40%～60% 融合时，弃去培养基，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤2次，向各孔中加入840µl转染增强试剂和100 µl poly，随后将Lv-shRNA-YAP1、Lv-shRNA-NC 各60µl 分别加入相应孔中。每隔24 h 换液1次，72 h后将六孔板置于倒置荧光显微镜下观察慢病毒感染效率，以慢病毒感染效率超过80%视为感染成功。

1.2.3 RT-PCR 实验检测mRNA 相对表达量 细胞总RNA 采用Trizol 法，用紫外分光光度仪测定总RNA 浓度与纯度。按照mRNA 反转录试剂盒操作说明进行反转录，参照 SYBR®Premix Ex Taq TM 试剂盒说明进行 RT-PCR 检测，计算相对定量结果。

1.2.4 免疫印迹试验（Western blot，WB）检测蛋白相对表达量 细胞弃去培养基，PBS 洗涤3 次，加入适量混匀的细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min 收集细胞，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min（半径10 cm），取上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，以相同蛋白上样量，煮沸变性后进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后使用半干转仪转移至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，1%脱脂牛奶稀释一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST 洗脱，37 ℃孵育二抗1 h，PBS洗涤3次，ECL化学发光剂显影。

1.2.5 细胞计数8（Cell Counting Kit-8，CCK8）实验检测细胞增殖能力及对不同浓度顺铂敏感性 收集对数生长期细胞，离心后重悬细胞，调整悬液细胞浓度至5 000个/ml，96孔板每孔加入细胞悬液100µl，每组3 个复孔，常规培养。分别于0 h、24 h、48 h、72 h 时于每孔加入10 µl CCK8 试剂，继续置于培养箱中放置2 h，酶标仪测定其在450 nm处的吸光度（OD）值。以相对应OD 值表示细胞增殖能力大小，绘制细胞生长曲线。

收集对数生长期细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度至5 000 个/ml，96 孔板每孔加入细胞悬液 100 µl，每组 3 个复孔，常规培养48 h。每孔加入10 µl CCK8 试剂，继续培养2 h，酶标仪测定其在450 nm处的OD值，测定顺铂抑制胃癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）及胃癌细胞SGC-7901对不同浓度顺铂敏感性。

1.2.6 划痕实验检测细胞运动能力 各组细胞按2×105个/孔接种于6 孔板中，常规培养，待细胞贴壁为单层细胞状态时，于超净台中，采用无菌10µl枪头垂直于6孔板划线，各做3 条横线与垂直的竖线，采用PBS 缓慢冲洗6 孔板，去除划线处理的细胞。常规培养24 h，于光学显微镜下观察划痕处细胞运动情况。细胞运动率（%）=（初始划痕宽度-24 h后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.7 Transwell 实验检测细胞迁移能力 取对数生长期细胞制成5×105个/ml 无血清细胞悬液，每个Transwell 小室中加入200 µl 细胞悬液，并在24 孔板每孔对应加入600µl的完全培养基，将小室放入孔中，培养箱培养24 h，进行固定及染色。计数穿过微孔移到滤膜下层的细胞总数，共计数中央及四周各5个视野并取其平均值。

1.2.8 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 50 µl Matrigel 胶包被于Transwell 小室底部，37 ℃静置 2 h，进行Matrigel 胶预处理。取对数生长期细胞制成1×106个/ml 无血清细胞悬液，向每个铺胶的Transwell 小室中加入200 µl细胞悬液，并在24孔板每孔对应加入600µl的完全培养基，然后将小室放入孔中，培养箱培养24 h，进行细胞固定及染色。计数穿过微孔移到滤膜下层的细胞总数。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组数据间比较采用方差分析，两组数据间均数比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 YAP1 在人胃癌细胞SGC-7901 中的表达情况与正常胃上皮黏膜细胞 GES1［mRNA（1.00±0.03），蛋白（1.00±0.02）］比较，YAP1 在胃癌细胞SGC-7901 中呈高表达［mRNA（6.43±0.43），蛋白（2.54±0.13）］，差异均有统计学意义（t=11.821、8.371，均P＜0.05）。见图1。

图1 YAP1 在人胃癌细胞SGC-7901 中的表达情况（A 为YAP1 mRNA 在人胃癌细胞SGC-7901 中的表达情况，B 为YAP1 蛋白在人胃癌细胞SGC-7901中的表达情况）

2.2 慢病毒转染效率评价 荧光显微镜下观察可见，胃癌细胞SGC-7901 感染慢病毒颗粒Lv-shRNA-YAP1、Lv-shRNA-NC 培养72 h 后，可见80%以上细胞有明显绿色荧光标志，提示慢病毒感染效率良好。见图2。

图2 慢病毒转染效率评价（左侧列为光学显微镜下慢病毒转染情况；右侧列为荧光显微镜下慢病毒转染情况，绿色荧光蛋白 ×40）

2.3 YAP1 对人胃癌细胞SGC-7901 增殖能力的影响空白对照组胃癌细胞在24 h、48 h、72 h 的增殖能力分别为（0.44±0.05）、（0.72±0.05）、（0.97±0.04），Lv-shRNA-NC 组分别 为 （0.40±0.05） 、（0.68±0.04） 、（0.92±0.05） ，Lv-shRNA-YAP1 组 分 别 为（0.34±0.04），（0.52±0.04），（0.73±0.05），与 空 白 对 照 组 和 Lv-shRNA-NC 组 比 较 ，Lv-shRNA-YAP1组胃癌细胞在24 h、48 h、72 h的增殖能力均明显较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图3。

图3 YAP1对人胃癌细胞SGC-7901增殖能力的影响

2.4 YAP1 对人胃癌细胞SGC-7901 运动能力的影响空白对照组的细胞运动距离（82.32±4.53）%，Lv-shRNA-NC组 为（84.42±5.42）% ，Lv-shRNA-YAP1 组 为（51.42±5.31）% ，Lv-shRNA-YAP1 组 与 空 白 对 照 组 和Lv-shRNA-NC 组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图4。

图4 YAP1对人胃癌细胞SGC-7901运动能力的影响（A为划痕实验光学显微镜观察结果 ×40；B为划痕实验细胞运动率计算结果）

2.5 YAP1 对人胃癌细胞SGC-7901 迁移能力的影响空白对照组细胞迁移为（543±43）个，Lv-shRNA-NC 组为（523±51）个、，Lv-shRNA-YAP1组为（432±44）个，与空白对照组和Lv-shRNA-NC 组细胞比较，Lv-shRNA-YAP1 组细胞迁移能力明显较低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图5。

图5 YAP1对人胃癌细胞SGC-7901迁移能力的影响（A为Traswell细胞迁移实验光学显微镜观察结果，龙胆紫染色 ×40；B为Tras⁃well细胞迁移实验计数结果）

2.6 YAP1 对人胃癌细胞SGC-7901 侵袭能力的影响空白对照组细胞侵袭为（586±54）个，Lv-shRNA-NC 组（573±54）个，Lv-shRNA-YAP1组（485±53）个。与空白对照组和Lv-shRNA-NC 组细胞比较，Lv-shRNA-YAP1 组细胞侵袭能力明显较小，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图6。

图6 YAP1 对人胃癌细胞SGC-7901 侵袭能力的影响（A 为Traswell 细胞侵袭实验光学显微镜观察结果，龙胆紫染色 ×40；B 为Traswell细胞侵袭实验计数结果）

2.7 顺铂对人胃癌细胞SGC-7901 增殖的抑制作用当顺铂浓度为 0.5 µg/ml、1.0 µg/ml、2.0 µg/ml、4.0 µg/ml、8.0 µg/ml 时，Lv-shRNA-YAP1 组胃癌细胞 SGC-7901 存活率均明显低于空白对照组和Lv-shRNA-NC 组（P＜0.05），空 白 对 照 组 顺 铂 对 细 胞 的 IC50为（4.43±0.32）µg/ml，Lv-shRNA-NC 组顺铂对细胞的 IC50为（4.18±0.42）µg/ml，Lv-shRNA-YAP1组顺铂对细胞的IC50为（1.48±0.33）µg/ml，明显低于空白对照组和Lv-shRNA-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同顺铂浓度对人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用

2.8 YAP1 影响人胃癌细胞SGC-7901 顺铂敏感性的信号通路作用 空白对照组细胞中IGF、Akt、TGF-β 的mRNA 和蛋白相对表达量分别为（1.00±0.03）、（1.00±0.02）、（1.00±0.04），（1.00±0.02）、（1.00±0.04）、（1.00±0.03），Lv-shRNA-YAP1 组 分 别 为（0.58±0.03）、（0.62±0.03）、（0.39±0.03），（0.78±0.03）、（0.73±0.03）、（0.74±0.05），顺铂组 分 别 为（0.67±0.02）、（0.73±0.03）、（0.40±0.02），（0.72±0.04）、（0.74±0.04）、（0.77±0.05），Lv-shRNA-YAP1 组和顺铂组细胞中IGF、Akt、TGF-β的mRNA和蛋白相对表达量明显优于空白对照组细胞（均P＜0.05），Lv-shRNA-YAP1+顺铂组细胞中 IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA 和蛋白相对表达量［（0.70±0.02）、（0.68±0.03）、（0.34±0.04），（0.51±0.03）、（0.46±0.03）、（0.55±0.05）］则明显低于Lv-shRNA-YAP1 组和顺铂组（均P＜0.05）。与空白对照组细胞比较，Lv-shRNA-YAP1 组细胞中 IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA 和蛋白相对表达量均明显较低（均P＜0.05），顺铂组细胞中IGF、Akt、TGF-β mRNA 和蛋白相对表达量也明显低于空白对照组细胞（均P＜0.05），Lv-shRNA-YAP1+顺铂组细胞中IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA、蛋白相对表达量则进一步低于Lv-shRNA-YAP1 组和顺铂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨 论

胃癌的发生受多基因共同作用影响，与环境、生活习惯、遗传、幽门螺杆菌感染等危险因素密切相关［7］。化疗是胃癌手术治疗及保守治疗的主要治疗措施，在胃癌的临床治疗中一直占据着重要地位。顺铂作为DNA 直接作用铂类药物，是胃癌化疗的一线临床药物，但顺铂耐药的发生仍在一定程度上限制了化疗干预的有效性［8］。寻找有效方法逆转胃癌对顺铂的耐药性，提高患者的临床疗效迫在眉睫。

目前，肿瘤细胞耐药的相关机制并未完全明了，有研究认为，细胞耐药与细胞的增殖、凋亡紊乱有关［9-10］。研究发现，过表达原钙黏蛋白10 可抑制人胃癌细胞BGC823 的增殖，并通过下调磷脂酰肌醇-3激酶、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、p70 核糖体蛋白S6 激酶mRNA 和蛋白表达，增强肿瘤细胞的顺铂化疗敏感性［11］。刘蒙等［12］研究也指出，靶向沉默CDH10 可通过抑制顺铂耐药细胞的增殖能力，提高胃癌细胞对顺铂的敏感性，提示细胞增殖调节在肿瘤细胞的顺铂耐药敏感中发挥着重要作用。YAP1 是一种具有多种功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子，是果蝇蛋白激酶（Hippo）信号转导通路的重要组成因子，在细胞增生和凋亡平衡的维持中扮演着重要角色［13］。研究指出，YAP1表达异常可导致Hippo 信号通路活化，打破细胞增殖与凋亡平衡，调节细胞向恶性转化［14］。近年来研究发现，YAP1表达升高与肿瘤的发生发展密切相关，其在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等多种水体肿瘤中活性增强，提示其具有潜在的致癌潜能［15-17］。有关胃癌与 YAP1 的研究指出，YAP1 在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且其表达水平与患者的 TNM 分期具有明显相关关系［18］。吴卫莉等［19］研究也指出，YAP1 高表达与胃癌临床分期及不良预后密切相关，提示YAP1 可能作为预测胃癌的分子标志物。但关于YAP1 与胃癌化疗敏感性的研究仍鲜有报道。本研究通过构建YAP1靶向沉默慢病毒，并感染胃癌细胞形成稳定沉默YAP1 的细胞株，于体外实验中探索性探究YAP1 对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为能力的影响，结果显示，胃癌细胞中YAP1相对表达量明显高于正常胃黏膜上皮细胞，且沉默YAP1 表达，胃癌细胞增殖、运动、迁移、侵袭能力明显降低，提示YAP1 与胃癌细胞的增殖、运动、迁移、侵袭密切相关。体外顺铂敏感性实验结果显示，在不同顺铂浓度下，沉默YAP1 组胃癌细胞存活率及顺铂对细胞的IC50均明显较低，为（1.48±0.33）µg/ml，表明抑制YAP1可改善胃癌细胞对顺铂的敏感性。

有研究发现，髓母细胞中YAP1 可诱导IGF 表达，并通过改善Akt活性强化细胞的放射抵抗力，促进放疗后肿瘤细胞的生长，促进细胞再生［20］。与此同时也有研究指出，TGF-β 是YAP1 调节细胞生长、分化过程中的一个重要的转录共激活因子，在胞内信号分子SMADs 蛋白的协助下，YAP1 可参与TGF-β 的信号转导作用，参与细胞分化过程和分化进程的调节［21］。基于此，本研究对沉默YAP1及顺铂干预后，不同组别胃癌细胞中YAP1及其下游相关基因和蛋白的表达水平进行检测，结果发现，感染Lv-shRNA-YAP1 和顺铂干预的胃癌细胞中IGF、Akt、TGF- β 的 mRNA 和 蛋 白 相 对 表 达 量 较 低 ，Lv-shRNA-YAP1 联合顺铂干预胃癌细胞中IGF、Akt、TGF-β mRNA 和蛋白相对表达量则进一步降低，提示沉默YAP1联合顺铂干预对YAP1及其下游靶基因的调节作用更为显著，表明靶向沉默YAP1表达逆转胃癌细胞顺铂敏感性可能也下调下游IGF、Akt、TGF-β基因及蛋白表达有关。

综上所述，YAP1蛋白在胃癌细胞SGC-7901中高表达，靶向沉默 YAP1 表达可通过下调 IGF、Akt、TGF-β 表达，抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖、迁移、侵袭，提高肿瘤细胞的顺铂敏感性。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。