虎杖苷对脂多糖介导的皮肤成纤维细胞损伤的保护作用

陈白烨 林博 王学明

1福建省妇幼保健院整形外科，福州 350000；2福建医科大学附属第一医院麻醉科，福州 350000

创面的修复包括炎性反应期、肉芽形成期、肉芽改建期等，该过程复杂而有序，是由多种细胞完成的，其中皮肤成纤维细胞是其中的重要组成部分［1-2］。研究证实，成纤维细胞的增值、凋亡、氧化应激等参与创面的修复过程；而抑制成纤维细胞的氧化应激及凋亡，促进其增殖可以显著促进创面的愈合［3-4］。

以往研究中证实，虎杖苷可以显著促进大鼠创伤皮肤愈合［2］，但机制尚不清楚；虎杖苷可以改善脓毒症大鼠器官损伤中细胞凋亡、氧化应激及炎性反应［5-6］。因此，2021 年1 月至4 月，本研究探讨虎杖苷对脂多糖（LPS）介导的皮肤成纤维细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 人皮肤成纤维细胞购于上海赛佰慷生物科技有限公司；丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒及细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）购于上海碧云天生物科技有限公司。肿瘤坏死因子（TNF）-α 及白介素（IL）-6 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒购于Abclonal 生物科技有限公司。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法［terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物有限公司。

1.2 细胞培养及分组 人皮肤成纤维细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37 ℃及5% CO2下培养，待细胞生长至融合度达80%以上后传代。参照文献［7］，以5 mg/L LPS 刺激皮肤成纤维细胞建立实验模型，培养72 h后检测相关指标。

细胞随机分为4 组：正常对照组细胞接受正常培养处理；药物对照组细胞接受 50 µmol/L 虎杖苷处理［8］；实验组细胞接受5 mg/L LPS 处理；治疗组细胞接受5µg/ml LPS 及50µmol/L虎杖苷处理。

1.3 MDA 含量测定 收集细胞并裂解，参照说明书配置试剂盒工作液，95 ℃水浴反应60 min，酶标仪检测532 nm吸光值。

1.4 SOD 检测 收集细胞并裂解，参照说明配置试剂盒工作液，37 ℃孵育20 min，酶标仪检测560 nm处吸光值。

1.5 细胞活力检测 按照实验设计收集各组细胞至96 孔板，每孔加入 10 µl CCK-8 工作液，孵育 2 h 后酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.6 凋亡细胞检测 细胞经4%多聚甲醛固定，1%Triton X-100 通透，3% H2O2封闭后，与试剂盒中工作液（按说明配置）避光反应60 min，以hoechst 标记细胞核，FITC 二抗标记TUNEL 阳性细胞，在荧光显微镜下计数细胞凋亡率。

1.7 细胞培养液炎症因子检测 取细胞培养液，离心后取上清，参照说明书方法，ELISA 检测TNF-α 及IL-6水平。

1.8 统计学处理 应用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD 多重比较法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 虎杖苷对成纤维细胞活力及凋亡的影响 与正常对照组比较，实验组细胞活力显著下降，凋亡率显著增加（均P＜0.05）；与实验组比较，治疗组细胞活力显著增加，凋亡率显著下降（均P＜0.05）。见表1。

表1 虎杖苷对成纤维细胞活力及凋亡的影响（%，）

表1 虎杖苷对成纤维细胞活力及凋亡的影响（%，）

注：正常对照组细胞不接受任何处理；药物对照组细胞接受50µmol/L虎杖苷处理；实验组细胞接受5 mg/L脂多糖处理；治疗组细胞接受5 mg/L 脂多糖及50 µmol/L 虎杖苷处理；与对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

细胞凋亡0.50±0.02 0.70±0.02 12.70±0.11a 7.50±0.08ab 3 870.51＜0.01正常对照组药物对照组实验组治疗组F值P值6 6 6 6 100.00±2.30 101.00±2.50 78.00±5.90a 89.00±7.50ab 33.62＜0.01组别n 细胞活力

2.2 虎杖苷对成纤维细胞氧化应激的影响 与正常对照组比较，实验组细胞SOD 含量显著下降，MDA 含量显著增加（均P＜0.05）；与实验组比较，治疗组细胞SOD 含量显著增加，MDA含量显著下降（均P＜0.05）。见表2。

表2 虎杖苷对成纤维细胞氧化应激的影响（）

表2 虎杖苷对成纤维细胞氧化应激的影响（）

注：正常对照组细胞不接受任何处理；药物对照组细胞接受50 µmol/L 虎杖苷处理；实验组细胞接受5 mg/L 脂多糖处理；治疗组细胞接受5 mg/L脂多糖及50µmol/L 虎杖苷处理；MDA 为丙二醛，SOD 为超氧化物歧化酶；与对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

MDA［nmol/（mg·pr）］1.54±0.18 1.49±0.14 3.38±0.29a 2.18±0.19ab组别正常对照组药物对照组实验组治疗组n 6 6 6 6 SOD［U/（mg·pr）］22.4±1.8 23.5±2.1 11.5±1.3a 19.1±2.2ab 124.56＜0.01 F值P值54.95＜0.01

2.3 虎杖苷对成纤维细胞炎性反应的影响 与正常对照组比较，实验组细胞培养基中TNF-α 及IL-6 含量显著增加（均P＜0.05）；与实验组比较，治疗组细胞培养基中TNF-α及IL-6含量显著下降（均P＜0.05）。见表3。

表3 虎杖苷对成纤维细胞炎性反应的影响（ng/L，）

表3 虎杖苷对成纤维细胞炎性反应的影响（ng/L，）

注：正常对照组细胞不接受任何处理；药物对照组细胞接受50 µmol/L 虎杖苷处理；实验组细胞接受5 mg/L 脂多糖处理；治疗组细胞接受 5 mg/ml 脂多糖及 50 µmol/L 虎杖苷处理；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α，IL-6 为白介素-6；与对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

IL-6 38.4±3.1 35.9±2.8 784.4±49.6a 518.5±42.2ab 905.06＜0.01组别正常对照组药物对照组实验组治疗组F值P值n6 6 6 6 TNF-α 53.5±4.6 63.2±6.5 483.5±38.4a 283.6±25.3ab 622.64＜0.01

3 讨 论

创面愈合过程主要包括炎症期、增殖期和修复期3 个时期［2］。炎性反应通过影响创面细胞增殖及创面重塑，在创面愈合过程中发挥重要作。大量研究证实，炎性反应通过影响成纤维细胞的活动，介导炎症因子的产生等多方面延缓创面愈合。王永祥和王春燕［9］证实，LPS抑制成纤维细胞增殖，并诱导其释放炎症因子。万立等［10］报道，LPS 通过抑制成纤维细胞增殖，导致烧伤创面瘢痕愈合或不愈合。因此，在许多研究中，主要通过LPS 刺激成纤维细胞，建立创面愈合炎症期细胞模型［7］。本研究通过LPS 刺激皮肤成纤维细胞，发现与上述研究相符的研究结果，证实LPS 可以显著抑制成纤维细胞增殖，并诱导大量炎症因子产生，包括TNF-α 及IL-6。而在创面愈合过程中，炎症因子通过影响细胞分化，活化炎症细胞，抑制内皮细胞及血管生成，从而导致瘢痕愈合或延缓创面愈合［11］。

大量研究证实，细胞凋亡参与了创面的愈合［3，12］。有研究报道，在炎症因子刺激下，内皮祖细胞动员减少，血管生成能力下降，成纤维细胞凋亡增加，迁移和增殖能力下降，进而导致创面愈合延缓，而通过对细胞分型发现，成纤维细胞的凋亡更加明显［13］。研究证实，氧化应激参与皮肤的衰老及创面的愈合，抑制氧化应激可以显著促进创面愈合［4，14］。大量研究还证实，氧化应激是介导炎性反应及细胞凋亡的重要因素［15-16］，其可能通过诱导炎症因子释放及细胞凋亡参与创面愈合。本研究证实，LPS 可以诱导成纤维细胞凋亡及氧化应激水平增加。在我们以往的研究中证实，虎杖苷可以显著促进大鼠创面愈合［2］，但机制尚未阐述清楚。在本研究中，我们证实虎杖苷可以显著减轻成纤维细胞氧化应激、炎性反应及细胞凋亡，促进细胞增殖。

综上，本研究推测虎杖苷可能通过抑制成纤维细胞氧化应激、炎性反应及凋亡，促进细胞增殖，从而促进创面愈合，但其作用靶点及机制仍需进一步的探讨。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。