整体柱固相萃取结合GC-MS鉴定中药苍术水煎液化学成分

张帆，程佳喆，焦盼，唐铖

（天津医科大学药学院天然药物学系，天津300070）

苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea或北苍术Atractylodes chinensis的干燥根茎[1]，具有燥湿健胃、祛风湿、明目、抗炎等功效，能治湿困脾胃、倦怠嗜卧、食欲不振、肢节酸痛、夜盲等症[2-4]。该药是医家最常用的中药之一。苍术发挥治疗疾病的作用与其所含的化学成分有关。故确定中药苍术所含化学成分组成对于该药作用机制的阐明以及临床应用都是有益的。传统的中药苍术化学成分研究多是采用GC-MS测定苍术醇提液的化学成分的方式进行[5-10]。然而，中药苍术多是以水煎剂的形式给药的。在多种中药复方中如黄柏苍术汤、麻黄苍术汤、秦艽苍术汤等几种中药复方中都含有该药[11-14]。国家药监局进一步提出了标准煎剂的概念，并制定了标准煎剂的质量评价标准。水煎剂与醇提液的化学成分组成有较大的差异。水煎剂中还含有多糖等大量水溶性杂质。这些杂质不仅干扰药效物质的测定，而且还会降低分析方法的灵敏度。故寻找一种适用于中药苍术水煎液中化学成分鉴定的方法就显得较为重要了。

整体柱是一种由有机或无机聚合方法在空柱中进行原位聚合的连续棒状整体材料[15]。与常规的填充型萃取柱相比，整体柱制备简单，可避免繁琐复杂的填装色谱柱过程；整体柱含有特殊的孔结构，渗透性良好，传质阻力小，可提高萃取效率[16]；还可通过选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化[17]。故本文探索将整体柱技术应用于中药苍术化学成分分析鉴定研究，结合GC-MS对中药苍术的化学成分进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 7890A-7975C GC-MS联用仪（美国）；BSA124S型十万分之一电子天平（赛多利斯股份公司）；循环水式真空泵（上海翔雅仪器设备有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KX-1740QT型超声波清洗器（深圳市科玺化工有限公司）；TGL-16M离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 材料 甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）、环己醇和十二醇购自阿拉丁生化技术公司。正己烷、甲醇（色谱纯，山东博城化学有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为国产分析纯。苍术（河北安国药材市场）经天津医科大学药学院唐铖副教授鉴定为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea的干燥根茎。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制 精密称取β-桉叶醇标准品适量，用正己烷溶解，定容至5 mL，摇匀，即得50μg/mL标准溶液。

1.3.2 供试品溶液的配制 称取适量苍术药材，粉碎，精密称取5 g粉末加入水50 mL，煎煮1.5 h，冷却至室温后补足失重，置于4℃保存备用。

1.3.3 整体柱的制备与表征 采用热引发聚合的方法在注射器中制备整体柱，聚合过程如下：将单体GMA、交联剂EDMA、致孔剂环己醇和十二醇、引发剂AIBN按照配比制成预聚溶液，加入离心管中超声混匀，然后通氮气10 min，将拔掉针头的注射器经脱气后抽取预聚溶液，封口后超声混匀10 min，60℃水浴聚合12 h，即得聚合物整体柱。反应结束后甲醇和水冲洗整体柱，除去未反应的单体和致孔剂。然后注入正丁胺，封闭整体柱两端，55℃水浴12 h。修饰完成后，分别用甲醇和水冲洗整体柱。在4 000~400 cm-1范围内获得FT-IR光谱，以观察疏水整体柱的官能团。

1.3.4 整体柱固相萃取分析苍术化学成分 将水煎液加入所制备整体柱，然后依次采用水、80%甲醇溶液作为洗脱液，收集的80%甲醇溶液洗脱部分，浓缩至干，正己烷重溶后进样分析。

1.3.5 传统方法分析苍术化学成分 采用正己烷萃取苍术水煎液化学成分，萃取液经微孔滤膜过滤后进样分析。

1.3.6 GC-MS分析条件 色谱条件：HP-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25μm）毛细管柱，程序升温：柱初始温度为70℃，以15℃/min升至255℃，保留10 min，再以15℃/min升至270℃。进样量1μL，维持10 min；溶剂延迟3 min；分流比为50∶1；气化室温度为250℃；载气为高纯度He（99.999%）。质谱条件：EI离子源；离子源温度为230℃；电离能量为70 eV；四极杆温度为150℃；EM电压2 165 V；接口温度为280℃；扫描质量范围m/z 100～650。

1.3.7 定性和定量 应用NIST 8.0谱库检索，并逐个解析各色谱峰相应的质谱图，对基峰、质荷比以及相对丰度等与标准图谱比较、鉴定。定量用峰面积归一化法计算各化学成分在挥发油中的相对百分含量。

2 结果

2.1 疏水整体柱制备及表征 为了获得具有良好渗透性和机械稳定性的整体柱，对不同聚合物整体柱进行柱背压试验，考察单体/致孔剂比例及致孔剂比例两个参数的影响。

2.1.1 十二醇含量 随着十二醇的增加，柱体内大孔的比例增加，导致柱压逐渐下降，渗透性和机械稳定性增加（表1）。此外，当十二醇的用量达到7%时，整体柱渗透性较差。当十二醇含量为10%时，整体柱柱背压低、渗透性和机械稳定性良好。

2.1.2 致孔剂配比 如表1所示，随着致孔剂总用量比的增加，整体柱材料孔隙率增多，结构疏松，使得整体柱的柱压下降，渗透性增加。综合考虑机械稳定性和渗透性等参数，选择9∶1（环己醇：十二醇）和1∶3（v/v）的单体与致孔剂的混合比例作为合适的配比。

表1 疏水整体柱的聚合参数Tab 1 Synthesisparameterson thehydrophobic monolithic column

2.1.3 疏水整体柱的表征 通过FT-IR表征得到的整体柱如图1所示。1 612 cm-1处易识别的峰较弱，对应于甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的双键聚合。在1 730 cm-1处的峰值是制备的整体柱中乙二醇-二甲基丙烯酸酯杂化物C=O键的特征吸收。3 422 cm-1处的N-H峰表明正丁胺成功修饰聚GMA-EDMA（甲基丙烯酸缩水甘油酯-甲基丙烯酸乙二醇酯）整体柱。

图1 疏水整体柱的红外光谱Fig 1 Infrared spectrum of hydrophobic monolithic column

2.2 整体柱固相萃取结合GC-MS分析方法学考察

2.2.1 精密度试验 取50μg/mL的β-桉叶醇标准品溶液，按“1.3.5”GC-MS条件进行分析，连续进样6次，结果显示，β-桉叶醇的相对标准偏差（RSD）为1.08%。

2.2.2 重复性试验 取同一批整体柱，按“1.3.4”项下方法平行萃取制备5份供试品溶液，按“1.3.5”项下GC-MS条件进样测定，记录峰面积，计算得到样品中β-桉叶醇的平均含量为35.26μg/mL，RSD为1.66%，表明该方法重现性良好。

2.2.3 加标回收率试验 对经过预处理样品中的β-桉叶醇进行加标回收率测定，按照相当于供试品中成分含量的80%、100%、120%比例加入β-桉叶醇对照品，按“1.3.4”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.5”项下GC-MS条件进样测定，记录峰面积，计算平均加样回收率，结果见表2。β-桉叶醇加样回收率在93.23%～104.52%，RSD为2.91%（n=9），表明该方法准确性良好。

2.3 苍术化学成分分析 应用GC-MS对整体柱固相萃取后的苍术水煎液样品进行分析，以面积归一化法计算各组分的相对百分含量，结合质谱计算机软件、NIST 8.0质谱库和文献资料共同分析，鉴定结果见表2。

表2 苍术的化学成分Tab 2 Thecomponentsof Atractylodeslancea

2.4 与传统分析方法对比 应用GC-MS分别对传统的正己烷萃取法及整体柱固相萃取后的苍术水煎液样品进行分析，得到总离子流图，见图2。从图中可以看出，传统方法水煎液所得到的色谱响应值（图2A）低于固相萃取法（图2B）。

图2 苍术水煎液总离子流图Fig 2 Total ion current chromatogram of Atractylodes lancea decoction

3 讨论

中药水煎剂是传统中医临床用药的主流，水煎煮也更接近服用药物的真实情况。在临床治疗过程中，苍术常被制成黄柏苍术汤、麻黄苍术汤、秦艽苍术汤等经典名方，且这些经典方剂大多以水煎剂的形式应用于临床[11-14]。研究苍术水煎液中的主要化学成分对于该类方剂的研究也是较为重要的。然而水煎剂中水溶性杂质较多，不仅影响对化学成分鉴定的准确性，还影响色谱的分离度。故本文以GMA为单体，EDMA为交联剂，环己醇和十二醇为致孔剂，AIBN为氧化还原引发体系，通过正丁胺修饰成功制备了渗透性良好的聚（GMA-EDMA-正丁胺）疏水整体柱。据报道苍术主要的有效成分是由倍半萜类和聚乙烯炔类等化学成分组成[6]，该类化学成分具有降血糖、抗凋亡、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等活性。而苍术传统水煎液中不仅包含此类化学成分，还包含多糖等水溶性的化学成分。这些杂质不仅干扰药效物质的测定，而且还会降低分析方法的灵敏度。故在本研究中建立并采用整体柱固相萃取苍术水煎液中化学成分。采用整体柱固相萃取可避免苍术水煎液中水溶性杂质对分析的干扰，结合GC-MS联用技术可对苍术水煎液的化学成分进行鉴定。β-桉叶醇等半萜类化学成分常被用于苍术的质量控制研究[18-19]。故本文也采用该化学成分进行方法学考察。结果表明该方法具有较好的精密度和准确度。

在洗脱溶剂的选择方面，在研究中比较了10%、50%、80%的甲醇。通过GC-MS的分析表明80%的甲醇可较完全的将苍术中的化学成分洗脱下来。故在后续研究中，采用该比例的甲醇进行洗脱；在GC-MS分析条件方面，本文考察了不同的分流比。随着分流比增大，GC-MS图谱的检出成分减少，分流比越小GC-MS检出成分越多，但定性分析发现，分流比较小时苍术GC-MS图谱中有少量柱流失物色谱峰。因此，综合色谱峰检出情况，实验选择分流比50∶1。

总之，本文制备并应用整体柱结合GC-MS分析对苍术水煎液中化学成分进行了鉴定。该方法操作简单、稳定性高、重复性好，回收率高，可为中药苍术水煎剂的整体质量评价与控制提供新思路。