高效液相色谱法测定口腔清洁护理用品中o-伞花烃-5-醇含量的研究

施裔磊 俞晓燕

(上海美加净日化有限公司，上海 200333)

1 研究背景

1.1 o-伞花烃-5-醇简介

o-伞花烃-5-醇(IPMP)，又名3-甲基-4-异丙基苯酚，分子式为C10H14O，摩尔质量为150.22g/mol，常温下为无色或白色针状晶体，易溶于甲醇、乙醇和异丙醇，可溶于乙二醇和丙二醇，不溶于水。IPMP目前作为一种抑菌剂被广泛应用于牙膏、漱口水、化妆品、药品等领域。

o-伞花烃-5-醇为源自于唇形科植物的天然提取物，为香精油的主要成分。由于生物膜表面的油质作用，传统的杀菌药物难以渗透至生物膜深处，故只能杀死表层细菌，无法对牙菌斑深处的细菌进行深层杀灭[1]。IPMP因与其疏水性、电解特性和摩尔质量有关的特性，可以穿透至菌斑深层进行抗菌作用，能够迅速浸入到菌膜内， 具有良好的渗透作用，用于牙膏中有抗牙菌斑、清新口气、保持牙龈健康的作用。经研究分析，IPMP能够直接作用于口腔细菌的生化反应酶或其他活性物质，从而影响细胞内酶的活性，降低酶活性或者直接使酶失活，最终导致细胞停止生长、细菌死亡[2]。

Karkar等[3]对含0.1% o-伞花烃-5-醇/0.6%氯化锌牙膏的护龈效果进行了研究。由224位受试者参与的临床实验数据显示，每天早晚两次使用该牙膏，连续刷牙6周和12周后，与使用传统含氟牙膏(含氟化钠0.204%)的受试者相比，使用含0.1%o-伞花烃-5-醇/0.6%氯化锌刷牙的受试者在6周和12周时，牙龈指数(GI)、出血指数(BI)及菌斑指数(PI)较前者均降低了12.3%、18.5%和13.2%及38.1%、37.8%和24.2%，并具有显著性差异。

陈雯杰等[1]采用悬液定量杀菌实验方法，对IPMP杀灭金黄色葡萄球菌的效果进行评价。结果以含5000 mg/L IPMP与50%二甲亚砜水溶液对悬液内金黄色葡萄球菌作用 5min，或5 000 mg/L IPMP溶液对悬液内金黄色葡萄球菌 15min，杀灭对数值均>5.00。结果表明 o-伞花烃-5-醇/二甲亚砜水溶液可有效杀灭金黄色葡萄球菌。陈敏珊等[4]研究将o-伞花烃-5-醇与葡萄柚提取物复配组合，并应用到牙膏等产品中。二者的联合使用对抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和变异链球菌均具有相加作用，特别是对抑制变异链球菌的相加作用明显。

1.2 o-伞花烃-5-醇的安全性

o-伞花烃-5-醇是一种安全性较高的化合物。经美国化妆品审查专家小组(CIR)评估[5,6]，小鼠急性经口毒性LD50为2.2g/(kg·bw)，属于低毒物质；采用含1%IPMP的凡士林对家兔进行眼刺激实验，4h内家兔结膜有轻微充血，24h内与对照组的结果相似，属微刺激性；采用含10%IPMP乙醇溶液对豚鼠进行皮肤刺激性实验，在皮肤表皮每天涂抹0.3mL剂量的受试物，连续3天，观察涂抹部位皮肤反应，皮肤刺激反应标准为0～4分，结果含10% IPMP乙醇溶液的得分为0.22，刺激性极低。对53名女性受试者皮肤刺激性临床实验数据显示，皮肤经涂抹含0.1%及1.0%的凡士林，24h后涂抹部位皮肤未出现刺激反应；对27名男性受试者皮肤致敏性临床实验数据同样显示，o-伞花烃-5-醇对皮肤的致敏强度极弱。同时，还有许多研究对 IPMP 的急性肠外毒性、短期口服毒性、短期肠外毒性、亚慢性口服毒性、和致突变毒性等方面进行评估，CIR专家小组得出化妆品中o-伞花烃-5-醇含量在0.5%的上限范围内使用是安全的。

目前，国内外相关法规如《化妆品安全技术规范(2015版)》、《牙膏用原料规范(GB22115)》、《欧盟化妆品法规 (EC)No 1223/2009》等均对o-伞花烃-5-醇在化妆品、牙膏等产品中作为防腐剂使用时的用量进行了规定，其在产品中的最大允许使用浓度均为0.1%。在日本，o-伞花烃-5-醇被作为一种抑菌成分广泛用于药品和日化产品中。其中，在牙膏等口腔健康产品中的最大允许浓度为0.05%。IPMP被FDA批准作为一种直接或间接的食品添加剂使用，CIR专家小组批准在化妆品中的使用浓度限制为0.5%。

1.3 研究现状

目前，关于o-伞花烃-5-醇含量的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法液和高效液相色谱法等。孙宗喜等[7]通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对柴胡根茎中的挥发油成分进行了分析和鉴定。结果显示，柴胡根和茎两部位共鉴定出了正己醛、2-戊基呋喃、棕榈酸、麝香草酚、o-伞花烃-5醇等95中化合物。其中，o-伞花烃-5-醇主要存在于柴胡的根中，采用GC-MS的方法进行定量分析，其含量为8.31%，是柴胡根挥发油中的主要化学成分之一。采用该方法研究得出，甘肃与湖北、河南等地所产柴胡挥发油在化合物种类和挥发油和含量上有较大的差异，为中草药化学组分的定性定量研究提供了科学的分析手段。

王娟等[8]研究用高效液相色谱仪来检测洗手液中3-甲基-4-异丙基苯酚(o-伞花烃-5-醇)的含量，该方法操作简单、准确快速，可以直接配制样品溶液检测，不需要样品前处理。其最低定量检测浓度为10mg/kg，相关系数R2=0.9997，o-伞花烃-5-醇在1μg/mL～200μg/mL的浓度范围内线性相关，回收率范围为98%～100%，相对标准偏差(RSD)为1.125%，表明该方法具有很好的准确度和可靠性。夏泽敏等[9]研究用高效液相色谱法测定化妆水、洁面乳及美白霜等化妆品中o-伞花烃-5-醇的含量，采用甲醇溶解样品，离心分离并过滤后直接进样分析，方法操作简便，准确度高，适用于不同配方体系化妆品中o-伞花烃-5-醇含量的检测，对规范化妆品中防腐剂的使用及保障消费者的健康安全有着积极的意义。

高效液相色谱法由于对高沸点，强极性，热不稳定，大分子复杂混合物的分离分析具有气相色谱法无法比拟的优势，因而其研究及应用更为广泛。本方法提出的高效液相色谱测定口腔清洁护理产品中o-伞花烃-5-醇含量的方法，相比其他检测方法，具有前处理简单、定性定量准确、检测结果不易受杂质或色泽干扰等诸多优点，与气质联用仪相比，液相色谱仪价格更加低廉，性价比较高，更适合在口腔护理用品生产企业和第三方检测机构中推广使用。

2 实验原理

牙膏样品用50%甲醇水溶液分散，经超声提取其中o-伞花烃-5-醇成分，然后离心分离并过滤处理，滤液用带二极管阵列检测器的高效液相色谱仪分析测定，采用外标法，通过峰面积定量计算样品中o-伞花烃-5-醇的含量。

3 分析条件的选择与优化

3.1 提取溶剂的选择

o-伞花烃-5-醇不溶于水，而牙膏试样在水溶液中经磁力搅拌和超声提取后，易于分散。若采用纯水作为本方法的提取溶剂，虽然可以将牙膏试样较好地分散，但纯水不能起到完全溶解o-伞花烃-5-醇的目的；另外，由于牙膏试样遇到甲醇会在表面形成硬壳，很难提取到牙膏内部，所以纯甲醇溶液也不适合作为本方法的提取溶剂。

所以，既要考虑到可以较好的溶解对照品，又要考虑到可以将牙膏试样分散并提取其中o-伞花烃-5-醇的目的，本方法最终选用甲醇/水溶液体系作为本方法的提取溶剂。

3.1.1 提取溶剂浓度的确立

由于牙膏中含有大量的增稠剂，用水分散时，水比例大时，一些增稠剂溶于水中，不利于微孔滤膜过滤；水比例小，又不利于牙膏分散均匀。为确定甲醇/水溶液最佳比例，称取1.0g(精确至0.0001g)牙膏试样于100mL容量瓶中，用0% ～ 100%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，磁力搅拌至均匀，超声提取10min后观察其溶解及分散情况。如表1所示，在50%甲醇水溶液中，o-伞花烃-5-醇对照品为略溶(1g“o-伞花烃-5-醇”在100mL的溶剂中溶解)，且该溶剂也可将牙膏试样较好的分散开，实验结果较为理想。

表1 对照品及牙膏试样的溶解性

3.1.2 提取时间的确立

采用磁力搅拌的方式将牙膏溶液搅拌至均匀，后放入超声波清洗器中进行超声提取。超声提取5min，10min，20min，30min，60min，测定峰面积。实验结果表明，将试样溶液超声10min后，在本方法色谱条件下，o-伞花烃-5-醇的峰面积几乎没有变化，可以达到提取平衡，所以最终选择10min作为本方法牙膏样品中目标物质的提取时间。

3.1.3 最终选择的前处理条件

牙膏试样：先挤去约20mm，再称取1g(精确至 0.0001g)试样于100mL烧杯中，用约80mL 50%甲醇水溶液溶解，磁力搅拌至分散均匀，超声提取10min后，转移至100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度。摇匀后，将试样溶液转移至50mL离心管中，4000r/min以上离心分离10min。冷却至室温后，上清液经0.45μm有机相滤膜过滤，备用。

漱口水试样：称取1g(精确至0.0001g)试样于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度。摇匀后，上清液经0.45μm有机相滤膜过滤，备用。

3.2 检测器及检测波长的选择

液相色谱连接的检测器有示差折光检测器、荧光检测器、质谱检测器、紫外检测器等。示差检测器通用性强、操作简单，凡是具有与流动相折光率不同的试样组分，均可使用示差折光检测器进行检测，但灵敏度低，流动相、环境温度的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于需要梯度洗脱试样的检测。质谱检测器灵敏度高，定性定量准确，但价格比较昂贵，难以在中小企业得到推广。荧光检测器只适用于具有荧光的有机化合物的检测，也不适合牙膏中，o-伞花烃-5-醇的检测。

紫外检测器是一种比较普及的检测器，适用于对紫外光或可见光有吸收性能试样的检测。其特点：使用面广、灵敏度高(检测下限为10g/mL)、对温度和流速变化不敏感、线性范围宽、可检测梯度溶液洗脱的试样。

按照本方法的色谱条件，在190～400nm下进行紫外扫描，如图1所示，o-伞花烃-5-醇在195nm、216nm及279nm均有最大的吸收，由于在195nm及217nm波长处如甲醇溶剂等干扰物质吸收较多，出峰情况较为复杂，易对测定结果产生干扰。同时，考虑到牙膏试样组分复杂，为了能准确测定其含量，选择279nm作为紫外检测器的检测波长。

图1 对照品o-伞花烃-5-醇的紫外扫描谱图

3.3 流动相条件的选择

3.3.1 水相的选择

在反相色谱中，在流动相中加入磷酸二氢钾，能使流动相保持一定的离子强度，可改善峰型，减少拖尾。但盐浓度过高，又容易损伤色谱柱。基于文献资料，选择乙腈作为有机相，磷酸二氢钾缓冲溶液作为水相，比较不同浓度及pH条件磷酸二氢钾缓冲溶液对o-伞花烃-5-醇峰形的影响。

如表2所示，当磷酸二氢钾缓冲溶液浓度为10mmol/L时，目标峰的不对称度为0.99，已经达到了实验的要求；如表3所示，当pH值在3.5～4.7的范围内，磷酸二氢钾缓冲溶液对色谱峰与溶剂峰的分离度没有明显的影响，所以，实验过程中无需在对10mmol的磷酸二氢钾缓冲溶液的pH值进行调整。综合表2及表3的实验结果，本方法流动相中最终选择的水相条件为：磷酸二氢钾缓冲溶液(10mmol/L)。

表2 磷酸二氢钾缓冲溶液浓度对o-伞花烃-5-醇色谱峰不对称度的影响

表3 不同流动相pH对于实验结果的影响

3.3.2 有机相的选择

固定水相为10 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，分别比较采用有机相乙腈和甲醇时的出峰情况。发现乙腈比甲醇有较好的洗脱性，出峰情况也更佳。故本方法选择乙腈作为流动相中的有机相。

3.3.3 流动相比例的选择

调节流动相中有机相与水相的比例可改变“目标物质”出峰的时间及峰形。为此，考察了流动相体系中“乙腈”与“磷酸二氢钾缓冲溶液(10mmol/L)”的比例对o-伞花烃-5-醇出峰情况的影响。当流动相中乙腈∶磷酸二氢钾缓冲溶液(10mmol/L)=38∶62(V/V)时，o-伞花烃-5-醇色谱峰与溶剂峰的分离情况较好，o-伞花烃-5-醇的出峰时间约为15.0min左右。综合考虑各个因素，最终选择乙腈∶磷酸二氢钾缓冲溶液(10mmol/L)=38∶62(V/V)时，流量为1.5mL/min时，即可以达到较理想的分离效果。

3.4 色谱条件的优化

按照3.1～3.3确立的色谱条件，对照品色谱图如图2所示，分析一个o-伞花烃-5-醇对照品溶液需要的时间为16min。

图2 对照品液相色谱图(等度洗脱)

由于牙膏配方体系复杂，在用以上色谱条件分析市售不含o-伞花烃-5-醇的阴性牙膏试样时发现，在20min左右会有一个很大的“杂质峰”(如图3所示)；另外，通过分析市售的其他约40款阳性和阴性牙膏试样的色谱峰发现，在20min左右均会出现该“杂质”色谱峰，说明该“杂质”为牙膏体系中的主要成分，具有普遍性。在本方法中，若将“牙膏试样”的进样时间定为16min，则在“牙膏试样”连续进样的过程中，牙膏试样中目标物质的色谱峰会受到前面几针未出尽的“杂质峰”的影响，从而影响了方法的精密度；若将“牙膏试样”的进样时间定为60min以上，则分析时间太长，降低了工作效率。

图3 阴性牙膏试样液相色谱图(梯度洗脱)

所以，在连续进样时，为了使组分复杂的样品不干扰下一个样品检测，同时，也为了加快分析样品的时间，使得“等度洗脱”时“20min”出现的“杂质峰”尽快走出色谱柱，采用梯度洗脱的方式(如表4所示)，35min即可分析一个样品，提高了检测效率。

表4 梯度洗脱程序

按照表4中的梯度洗脱程序，市售含o-伞花烃-5-醇的牙膏试样及口腔喷雾剂产品的色谱图分别如图4、图5所示。

图4 市售某含“o-伞花烃-5-醇”牙膏试样液相色谱图(梯度洗脱)

图5 市售某含“o-伞花烃-5-醇”口腔喷雾剂液相色谱图(梯度洗脱 )

3.5 最终仪器条件

液相色谱柱参数：Dionex AcclaimTM 120型C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)及配套保护柱(4.0mm×10mm，5μm)；检测器：紫外检测器；检测波长：279nm；柱温：30℃；进样量：20μL。o-伞花烃-5-醇对照品用等度洗脱方式分析，牙膏试样用梯度洗脱方式分析，洗脱程序如表4。

3.6 方法性能指标

3.6.1 方法的线性关系

分别配制浓度为1.0μg/mL，2.5μg/mL，5.0μg/mL，7.5μg/mL，10.0μg/mL，12.5μg/mL，15.0μg/mL，在本方法的色谱条件下进样检测，并以o-伞花烃-5-醇对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归，得标准工作曲线及回归方程见表5，图6。实验结果显示，在1.00～15.0μg/mL的浓度范围内，对照品质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。

表5 对照品o-伞花烃-5-醇的回归方程、相关系数和线性范围

图6 对照品o-伞花烃-5-醇标准工作曲线

3.6.2 对照品稳定性实验

配制浓度约为 10.0μg/mL 的o-伞花烃-5-醇对照品溶液，考察对照品浓度在10日内的稳定性。如表6所示，对照品溶液中o-伞花烃-5-醇含量10日内测定结果的RSD为0.75%，说明对照品溶液存放一周后其o-伞花烃-5-醇含量仍然比较稳定。

表6 o-伞花烃-5-醇对照品(10.0μg/mL)10日稳定性实验

3.6.3 方法的最低检出浓度和最低定量浓度的确定

将对照品溶液稀释进样，测定峰高信噪比为10∶1时o-伞花烃-5-醇浓度确定为方法的定量浓度；测定峰高信噪比为3∶1时添加的o-伞花烃-5-醇浓度确定为方法的检出浓度。

向不含o-伞花烃-5-醇的阴性牙膏试样中定量添加标准溶液，按照前处理方法处理后，测定峰高信噪比为10∶1时o-伞花烃-5-醇浓度确定为方法的定量限；测定峰高信噪比为3∶1时添加的o-伞花烃-5-醇浓度确定为方法的检出限。以上测定结果如表7所示。

表7 方法的检出限、定量限、检出浓度和定量浓度

3.6.4 系统适用性实验

精密吸取同一浓度为 10.0μg/mL 的ο-伞花烃-5-醇对照品溶液，在本色谱条件下，连续6次进样(等度洗脱)，测定其峰面积及保留时间。结果显示，ο-伞花烃-5-醇峰面积的RSD为0.20%，保留时间的RSD为0.06%。

3.6.5 方法的精密度

精密称取某含ο-伞花烃-5-醇的市售牙膏试样1份，每份约1g(精确至0.0001g)，按前处理条件处理后，连续 6次进样(梯度洗脱)，测定目标峰其峰面积及保留时间。结果显示，牙膏中ο-伞花烃-5-醇峰面积的RSD为0.91%，保留时间的RSD为0.36%，牙膏样品中目标物质含量的RSD为0.92%。

精密称取某含ο-伞花烃-5-醇的牙膏试样6份，每份约1g(精确至0.0001g)，按前处理条件处理后，按本方法确定的色谱条件进行测定，测得试样中ο-伞花烃-5-醇的平均含量为440.1μg/g，RSD为1.63%。

3.6.6 方法的加标回收率

目前国内市售牙膏样品配方中的磨擦剂体系主要分为碳酸钙、二氧化硅及磷酸氢钙三种。为考察本方法对不同磨擦剂体系牙膏样品的适用性和检测结果的准确性，选取三种具有代表性的市售阴性牙膏试样，分别进行低、中、高三个添加水平的加标回收率试验，按照本方法的前处理条件及色谱条件进行测定，计算回收率，如表8所示，o-伞花烃-5-醇在添加浓度100～400mg/kg范围内，回收率在98.42%～101.39%之间。

表8 牙膏试样加标回收率试验结果

3.6.7 干扰因素的排除

麝香草酚，又名2-异丙基-5-甲基苯酚，是我国《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准(GB2760)》中允许使用的食品香料。在牙膏、漱口水等香精中也会添加使用。麝香草酚与o-伞花烃-5-醇为同分异构体，为考察本方法色谱条件下，麝香草酚的出峰情况是否会对目标物产生干扰，对以上两种物质进行了色谱分析，考察两种物质在同一色谱条件下的分离情况。如图7所示。

图7 本方法条件下目标物与麝香草酚的分离情况

在本方法色谱条件下，o-伞花烃-5-醇与麝香草酚可以完全分离，所以，样品中麝香草酚的存在不会影响本方法中目标物质的检测。

4 结果与讨论

4.1 市售口腔护理产品中o-伞花烃-5-醇含量的检测

牙膏，漱口水等口腔护理产品配方成分复杂，各企业产品配方，所用原料等都不尽相同。为验证在本色谱条件下，对于不同配方体系牙膏等产品，是否存在影响目标物质检测的干扰因素，收集了市场上具有代表性的45款牙膏、漱口水和口腔喷雾剂产品。其中1款牙膏及1款口腔喷雾剂包装的成分表上标注添加“o-伞花烃-5-醇”成分，另外43款产品的成分表上未标注。

检测结果显示，1款牙膏中o-伞花烃-5-醇的含量为440.0mg/kg，1款口腔喷雾剂中的含量为185.8mg/kg，另外43款产品中o-伞花烃-5-醇的含量为“未检出”。以上检测结果与产品成分信息一致，且符合国家相关法律法规中对于o-伞花烃-5-醇限量使用的要求。同时，也验证了本方法对于不同配方体系口腔护理产品的适用性。

4.2 方法验证

为考察在本方法色谱条件下，在不同实验室及操作环境下实验结果的平行性和准确性，邀请了3家检测机构及1家口腔护理用品生产企业的实验室对本方法的实验条件进行了验证。如表8所示，在重复性实验条件下，四家实验室标准工作曲线的线性良好，R2在0.9997～0.9999之间；回收率均能满足标准文本的回收率要求，o-伞花烃-5-醇在添加浓度100mg/kg～400mg/kg范围内，本标准方法的回收率在96.3%～101.4%之间；方法的精密度良好，相对标准偏差(n=6)在0.41%～1.63%之间；对于同一款牙膏样品(含o-伞花烃-5-醇)，四家实验室检测结果的相对标准偏差为2.06%。

表9 方法验证情况汇总

5 结论

综上所述，本法利用高效液相色谱法，对牙膏中的o-伞花烃-5-醇进行了定性、定量的研究。方法具有简便快捷，具有重复性好，灵敏度高等特点。适用于对口腔护理产品，如牙膏、漱口水、口腔喷雾剂等产品中o-伞花烃-5-醇含量的检测和控制，为生产企业和质量检测机构提供了科学有效的检测方法，对规范口腔护理产品中防腐剂的使用，及保护消费者的健康安全有着积极的意义。