地黄促生内生尖孢镰刀菌GG22基因组结构分析

朱畇昊　彭淑萍　赵乐　董诚明

摘要：通过高通量测序分析1株能够促进地黄生长及次生代谢产物积累的内生尖孢镰刀菌的基因组结构，推测其内生及促生机制。使用Illumina Hiseq X ten双端测序技术对内生真菌GG22进行基因组测序，并进行生物信息学分析。分析结果，共得到17 296个预测的基因，其中基因的总长度26 937 813 bp，平均基因长度为1 557.4 bp。与KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能数据库进行BLAST比对，共有17 202个基因得到功能注释，注释率为99.46%，其中有3 801个基因注释到KEGG数据库中;7 431个基因注释到KOG数据库中;11 548个基因注释到 Pfam 数据库中;9 007个基因注释到 Swissprot数据库中;17 201个基因注释到TrEMBL数据库中，且分别有881、5 247、158个基因被注释到CAZyme、PHI、TCDB数据库。基因功能分类分析发现，尖孢镰刀菌GG22的细胞运动和细胞外结构不发达，这可能是其成为地黄块根寄生内生菌的原因之一。基因簇分析得出，GG22可能能够产生碧卡维林等化合物而抑制其他微生物的生长，同时保护寄主植物免受其他病原菌的侵害，成为地黄促生内生真菌。通过对GG22基因组结构进行分析，初步获得了其内生性生物学基础，为进一步阐明其促进地黄生长及次生代谢产物积累奠定了基础。

关键词：地黄;内生真菌;尖孢镰刀菌;基因组;次生代谢

中图分类号：S567.23+9.01;S182 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）19-0072-06

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄参科地黄属多年生草本植物，常以干燥块根入药，是中医常用的中药材之一。笔者所在实验室前期从野生地黄中分离出1株内生真菌GG22，经鉴定其为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。有研究报道，尖孢镰刀菌可作为土传性病原真菌侵染三七[1]、半夏[2]、大黄[3]等多种药用植物，造成药用植物的枯萎病或腐烂病，严重影响药材的产量和质量。本研究所使用的GG22为地黄植株内分离获得的内生真菌，不会引起地黄病害，与地黄共生后能显著提高地黄的株高、株幅，且可显著提高地黄植株中次生代谢产物的积累[4]。

近年来，随着高通量测序技术的发展，多个病原性尖孢镰刀菌菌株已经完成了基因组测序[5-6]，从基因组水平鉴定获得了一系列致病相关的基因，为深入研究其致病的分子机制奠定了基础。GG22作为内生型尖孢镰刀菌，其基因组结构等信息还未见报道，这已经成为深入了解GG22的内生特性及其与寄主互作的障碍。因此，本研究选取地黄内生尖孢镰刀菌GG22进行基因组测序并组装，从基因组结构及基因组成角度，对GG22基因组进行注释，了解GG22基因组的组成特点，寻找细胞壁降解酶、病原菌-寄主互作相关基因、次生代谢合成相关基因等，分析GG22内生性的遗传基础，以期为后续研究GG22促进地黄生长及次生代谢产物合成积累的机制提供良好的基因组学基础。

1材料与方法

1.1试验材料

地黄内生真菌GG22保存于4 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1内生真菌GG22的DNA提取2018年12月，于河南中医药大学河南省道地药材生态种植工程技术中心组织实验室内开展相关试验。内生真菌GG22接种于PDA固体培养基活化3～4 d。挑取菌丝转入PDB液体培养基中摇培2～3 d（转速120 r/min，28 ℃）即得内生真菌GG22的种子液。以2%接种量接种于液体PDA中，培养3～4 d 即可，培养条件同上。过滤得GG22菌丝，洗净菌丝，立即冷冻送至北京百迈克生物科技有限公司。用试剂盒提取GG22基因组DNA，并检测浓度及质量。

1.2.2基因組DNA测序及组装超声波随机打断提取GG22样品的DNA，获得插入270 bp的片段，从而构建测序文库。构建文库进行桥式 PCR 后，通过Illumina Hiseq X ten双端测序。SOAP denovo软件对GG22菌株测序数据进行组装。

1.2.3基因组组分分析与功能注释EVM、Augustus、GlimmerHMM及SNAP2.2.2中组装好的基因组进行预测和整合，其中包括重复序列、编码基因、非编码RNA及假基因。所有预测基因的编码蛋白与KEGG、TrEMBL、Nr等通用功能数据库和CAZy、PHI等专用功能数据库做比对，即得基因相关的功能注释结果。利用SignalP 4.0和TMHMM可在所有预测到的蛋白序列中分别找出含有信号肽的蛋白和跨膜蛋白。利用anti-SMASH对GG22次生代谢产物合成基因簇进行预测。

2结果与分析

2.1基因组测序及组装

对GG22构建1个270 bp文库，共得到约 9.04 Gb 的原始数据。测序质量值在30以上的碱基比例不小于94.81%，Contig N90 的长度为 4 629 bp，G+C含量为47.49%。

2.2基因组组分分析

应用EVM、Augustus和GlimmerHMM等软件进行基因结构预测，共得到17 296个预测的基因，其中基因的总长度26 937 813 bp，平均基因长度为 1 557.4 bp。tRNAscan-SE预测基因组中有52种tRNA，数量为337个;Infernal1.1分析得到159个rRNA，并以其功能进行划分即分为3类，其他ncRNA有46个，分为33类。在GG22基因序列中利用Gene Wise寻找不成熟的终止密码子及移码突变，得到147个假基因，假基因总长度为172 834 bp，平均每个长度1 175.74 bp。

2.3基因组功能注释

与KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能数据库进行BLAST比对，共有17 202个基因得到功能注释，注释率为99.46%。其中有 3 801 个基因注释到KEGG数据库中;7 431个基因注释到KOG数据库中;11 548个基因注释到 Pfam 数据库中;9 007个基因注释到 Swissprot数据库中;17 201个基因注释到TrEMBL数据库中。碳水化合物相关酶数据库（CAZyme）可对碳水化合物酶类基因进行功能注释，其中包括供糖类化合物合成、碳水化合物活性酶分解的研究和信息。病原体-宿主互作因子数据库（Pathogen Host Interactions，简称PHI）收录多数具有毒力和效应基因的细菌、卵菌、真菌及其宿主信息，可从中寻找某菌株中与致病性相关的基因。转运蛋白分类数据库（Transporter Classification Database，简称TCDB）包含了生物体运输系统的分类、结构、功能等信息。分别有881、5 247、158个基因被注释到CAZy、PHI及TCDB这3个数据库。软件SignalP 4.0和 tmhmm在所预测到的基因的蛋白序列中，分别找出1 654个含有信号肽的蛋白、3 362个跨膜蛋白及1 238分泌蛋白。

2.3.1KOG注释从表1可以看出，选择利用KOGs（EuKaryotic Orthologous Groups）进行基因注释与功能分类， 共注释基因7 431个， 可分为25个功能组和4大类，分别为细胞过程及信号、信息储存及加工、代谢过程、功能特点不明显，分别注释基因数为1 660、1 164、2 817、1 736个基因，另有903个基因功能类别未知。尤其注意到的是，尖孢镰刀菌GG22的功能分类N（细胞运动）和W（细胞外结构），基因数量分别只有3个和8个，相比之下不是很多，可以分析出，尖孢镰刀菌GG22的细胞运动和细胞外结构不发达，这可能是其成为地黄块根寄生内生菌的内在原因之一。

2.3.2KEGG注释KEGG总共注释得到的物质代谢通路有111个（图1）。尖孢镰刀菌GG22中预测代谢通路在新陈代谢、细胞过程、遗传信息加工和环境信息加工等4大类中涉及的基因比较多。新陈代谢分类中，共有2 576个基因，细胞过程分类中，共有508个基因，遗传信息加工分类中，共有550个基因，环境信息加工分类中，共有189个。

2.3.3CAZyme注释真菌可以产生大量的碳水化合物活性酶，而该类物质是与真菌的生活方式可能紧密相关，同时也是真菌降解纤维素、果胶等植物细胞壁成分，从而与植物建立共生或寄生关系的重要酶类系统。CAZymes分为糖苷水解酶类（GHs）、糖基转移酶类（GTs）、多糖裂解酶类（PLs）、糖酯酶类（CEs）、糖结合模块（CBMs）等。本研究发现，GG22基因组中，GHs数量最多，共有375个;CEs共有205个;GTs共有121个;碳水CBMs共有118个;PLs共有26个（表2）。

植物的细胞壁是病原菌或内生真菌建立侵染关系的主要障碍，而CEs、PLs和GHs 3个家族的酶类被称为细胞壁降解酶，这些酶可能有助于真菌侵入宿主细胞，在真菌对于宿主的渗透和成功感染具有重要的作用。这些酶在尖孢镰刀菌侵染过程中的作用是当前研究的热门。从表3可以看出，GG22能分泌出几种不同的细胞壁裂解酶，如角质酶、果胶甲酯酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等，这些酶的发现可为进一步探索GG22的侵染过程奠定基础。

2.3.4PHI注释PHI为病原宿主互作数据库，主要收录与病原菌相关基因包括致病基因、毒力基因和效应蛋白基因。GG22基因组中有5 247条病原菌-寄主互作（PHI）相关基因，归属于90个PHI类型。对GG22基因组中基因缺失后引起真菌毒力增加的PHI类型进行了初步分析（表3），并对包含3条及以上基因的PHI类型进行了总结。PHI：4194共有45条，这些基因的存在可能是GG22维持内生生活的关键所在。

2.4次级代谢产物合成基因簇分析

本研究使用anti-SMASH对基因组进行次级代谢产物合成分析预测，基因组中共预测得到42个次级代谢产物基因簇，在预测到的基因簇中，萜烯类基因簇（Terpene）共有10个，占预测总基因数的23.80%;聚酮合酶基因簇（Polyketide synthase，简称PKS）共9个，占预测总基因簇的21.42%，其中T1pks含有8个，T3pks含有1个;非核糖体多肽合成酶基因簇（non-ribosomal peptide synthase，简称NRPS）共8个，占预测总基因簇的19.04%;T1pks-Nrps混合和吲哚类（Indole）基因簇各有3个，各占预测总基因簇的7.14%;其他类共有9个，占预测总基因数的21.43%（图2）。

将所有GG22基因簇与已知次级代谢产物基因簇進行BLAST比对发现，从表4可以看出，GG22的基因组中暗示着其具有合成Fusarubin、Alternapyrone等化合物及其衍生物的能力。碧卡维林（Bikaverin）[14]、白僵菌素（Beauvericin）[15]、Aspyridone[16]和Equisetin[17]类化合物都具有一定的抗真菌、细菌、病毒及抑制根结线虫的能力，而GG22基因组中具有合成上述化合物的相似基因簇，推测GG22可能能够产生碧卡维林等化合物，从而抑制其他微生物的生长，保护寄主植物免受其他病原菌的侵害，为其寄主提供一定的保护。镰红菌素（Fusarubin）类化合物是腐皮镰刀菌的特征次生代谢产物[18]，也能在腐皮镰刀菌与某些植物形成互利共生关系的过程中发挥作用。GG22基因组中1个T1pks基因簇（129182-176252）与Fusarubin合成基因组相似度为87%，说明GG22可能也具有合成Fusarubin类化合物的能力，而该类化合物可能与其能够与植物进行共生有一定的关系。 GG22中含

有合成 alternapyrone 类的相似基因，推测其具有代谢该类化合物的能力，而 alternapyrone 类化合物在相关生物酶作用下进一步合成萘并吡喃酮类化合物的是一种新型昆虫拒食素[19]。因此，GG22合成alternapyrone可保护其自身及寄主减少昆虫取食的风险。地普丁（Depudecin）是一种11碳线性聚酮化合物，是组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）的抑制，也是病原菌与寄主之间相互作用的毒力因子，但其毒力中的作用较轻[20]。白僵菌素（Beauvericin）[15]和镰刀菌酸（Fusaric acid）[21]是病原菌产生的非寄主特异性致病毒素，可促进病原菌的侵染。GG22基因组中与白僵菌素和镰刀菌酸合成基因簇相似度分别为20%、13%，相似度均较低，说明GG22可能具有合成类似化合物的能力，从而帮助自身完成对寄主植物的侵染，但GG22合成的类似化合物其毒力可能较轻，不足以使寄主致病。

根据笔者所在实验室之前的研究，体外液体培养GG22可以产生GA、IAA等植物激素，从而促进寄主植物的生长及次生代谢产物的积累。本研究在通过KEGG对萜类化合物合成途径分析时发现，发现在GG22中注释到参与萜类化合物合成途径的有32个基因，主要为泛醌和其他萜类醌的生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130）途径12个，萜类骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900）途径18个，但是缺乏二萜类生物合成相关基因。因此，GG22产生二萜类化合物GA的途径还并不清晰，这可能是与基因组序列拼接长度不够、注释不完全有关。在参与IAA生物合成的色氨酸代谢途径（ko00380）中，共发现57个基因编码的19个酶参与其中，这些基因可能参与GG22 GA、IAA等植物激素及其类似物的生物合成。

3讨论与结论

植物内生真菌是指能在植物组织内部定殖，但不引起寄主产生病害的一类真菌。有些内生真菌能够通过产生激素、解磷解钾等方式促进植物生长、提高寄主抗逆性和刺激寄主次生代谢产物合成。很多内生真菌其同种但不同的菌株却是病原菌，而与病原菌与植物互作相比，内生真菌与植物互作的分子机制还很不清楚。近年来，随着高通量测序技术的普及， 越来越多的病原真菌基因组被揭示，如稻瘟病菌、玉蜀黍黑粉菌、禾布氏白粉菌等，然而植物内生真菌基因组相关的研究报道还较少。植物病原真菌的全基因组测序分析可以为内生真菌相关研究提供参考。本研究通过对地黄内生真菌GG22进行全基因组测序，拼接得到基因组总长度26 937 813 bp，GC平均含量为47.49%。与KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能数据库进行BLAST比对，共有17 202个基因得到功能注释，注释率为99.46%，这些基因的注释为进一步了解GG22的生物學特性提供了基础数据。

真菌在物质代谢和循环中发挥着至关重要的作用，不同类型真菌具有不同的营养方式，如腐生真菌、寄生（病原）真菌、内生真菌等。真菌可以产生大量的碳水化合物活性酶，该类物质是真菌生长发育过程中极为突出的蛋白家族，与真菌的生活方式可能紧密相关。 万仁鹏等比较了97株腐生、病原及内生3种不同营养方式的真菌中CAZymes的含量[22]，发现腐生真菌含有的CAZymes最少，仅有200个左右，而内生真菌中约一半含有的CAZymes超过700个。本研究发现，内生尖孢镰刀菌GG22基因组中共有881个CAZymes，说明CAZymes可能在内生真菌侵染过程中发挥着重要的作用。

病原体寄主互作的相关基因是真菌致病的重要决定因子，基因产物直接体现在病原菌对寄主侵染环境的适应和反应，诱导植株发生病理反应。GG22基因组中有5 247条病原菌-寄主互作（PHI）相关基因，归属于90个PHI类型。与其他病原真菌相比，其PHI类型较少，这可能是与其为植物内生真菌，不引起寄主产生病害有关。PHI：4194，PHI：2393等类型基因失活导致病原菌响应寄主致病能力增强，因此推测这些基因在GG22维持生长而不致病的内生生活中发挥着重要的作用。

植物内生真菌能产生非常丰富的次生代谢产物，这些次生代谢产物可能在其生长过程中发挥着一定的作用，其次，内生真菌次生代谢产物很多都具有较好的生物学活性，有些内生真菌甚至能产生与寄主相同或相似的活性物质，这些活性产物可以作为新药开发重要的化合物库。GG22基因组中共预测得到42个次级代谢产物基因簇，包括萜烯类基因簇、聚酮合酶基因簇、非核糖体多肽合成酶基因簇、吲哚类基因簇等，暗示着GG22能够产生多种类型的次生代谢产物，而其可能产生的Fusarubin、Beauvericin 等物质可能对GG22的侵染、建立共生关系、保护寄主植物等发挥着一定的作用。

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基金项目：国家自然科学基金（编号：81603232）;国家重点研发计划（编号：2017YFC1702800）;河南省科技攻关计划（编号：172102310539）。

作者简介：朱畇昊（1986—），男，河南郑州人，博士，副教授，主要从事药用植物分子生物学研究。 E-mail：guxinhan123@163.com。

通信作者：董诚明，教授，主要从事中药材规范化种植研究。E-mail：dcm371@sohu.com。