药食同源材料组合中二氢杨梅素水提工艺优化

张荣彬 高文明 戴志勇 陈振桂 任国谱

(1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.英氏控股集团股份有限公司，湖南 长沙 410005)

药食同源材料组合是根据宋代医学家钱乙《小儿药证直诀》著名方剂“导赤散”加减而来，试验所用搭配及比例为：藤茶(30%)、桑叶(15%)、菊花(15%)、芦根(10%)、麦芽(10%)、甘草(10%)以及淡竹叶(10%)。

藤茶作为类茶植物已被广泛应用于食品行业，其有效成分为黄酮类物质(如蛇葡萄素、二氢杨梅素、杨梅素、福建茶素、龙涎香醇、β-谷甾醇、杨梅黄素和杨梅苷等)，具有降低体内寒气、清除燥热、降低血压与血脂并保护肝脏的作用[1-3]，其提取方法主要有水提法、醇提法、微波辅助萃取法以及超声提取法等[4]。桑叶的成分有黄酮类、多糖类、脂类、生物碱、挥发油、植物甾醇和绿原酸等[5]，其提取方法主要有热水、醇和稀碱等溶剂提取法；超声辅助乙醇提取桑叶黄酮类化合物耗时少且增效明显[6]。菊花主要含有黄酮类、多糖、挥发油和氨基酸等成分[7]；其黄酮类成分中二氢杨梅素可采取醇解法和热水提取[8]。芦根具有清热生津、除烦、止呕和利尿的作用；芦根含有糖类、黄酮类、蒽醌类、酚类、甾体类、小分子酚酸以及挥发性成分[9]等，可用水煎和醇沉淀法提取[10]。麦芽中含有较多功能性纤维素，如富含谷胺酰胺的蛋白质纤维素，可以治疗溃疡性结肠炎[11]，采用水提可发挥助消化作用，也可用90%乙醇回流提取[12]。甘草是一种补益中草药，其甘草总黄酮是甘草抗炎活性组分之一，而异甘草素是甘草总黄酮抗炎的活性成分[13]；药用成分主要包括甘草黄酮、甘草酸、甘草多糖和甘草次酸等，可用溶剂提取法、超声辅助提取法或者微波辅助提取法等进行提取[14]。淡竹叶的化学成分有黄酮类、三萜类、酚性成分、有机酸、氨基酸和糖类等[15]，可用水和甲醇提取或60%的乙醇回流提取[16]。

近年来，针对二氢杨梅素物质提取研究大多集中于单一物质材料，并未见对药食同源材料组合的提取研究。目前关于二氢杨梅素大多使用乙醇进行浸提[17-19]，也有使用丙酮[20]、超声波[21]和酶法[22]进行提取的，而用热水提取也可以达到一定的效果[23-26]，并且所用药食同源材料组合中各味药中的有效成分大都可以溶于热水且传统中药多为水煎，无有机溶剂的残留，在食品工业中能保证一定的安全性，在成本控制方面也具有无可比拟的优势。研究拟采用热水回流提取法提取药食同源材料组合中的二氢杨梅素，并优化其提取工艺，旨在为药食同源材料开发及浸膏粉的生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤茶、芦根、麦芽、甘草、淡竹叶、桑叶和菊花：桑植县华远生物科技有限公司；

二氢杨梅素：浓度>98%，北京坛墨质检科技有限公司；

磷酸、甲醇、乙腈：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：Waters e2695型，美国Waters公司；

电子分析天平：CP114型，上海奥豪斯仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KQ-5200DV型，昆山市超声仪器有限公司；

三用恒温水箱：HH-600型，金坛市神科仪器厂；

电热恒温鼓风干燥箱：WGL-125B型，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 取药食同源材料组合65 g，进行筛选除杂，选择m藤茶∶m桑叶∶m菊花∶m芦根∶m麦芽∶甘草∶m淡竹叶=30%∶15%∶15%∶10%∶10%∶10%∶10%，即藤茶19.5 g，桑叶、菊花各9.75 g，芦根、麦芽、甘草以及淡竹叶各6.5 g。

1.3.2 二氢杨梅素含量的测定 根据文献[27—28]并修改，具体操作：

(1)样品处理：取筛选除杂后的药食同源材料组合65 g，按照试验方案，加水浸泡，进行回流提取，过滤后收集、合并提取液，并将其定容至1 000 mL容量瓶后混匀，移取提取液各1 mL，置于5 mL EP管中，加入3 mL甲醇，摇匀，用0.45 μm微孔薄膜过滤，即得供试品溶液。

(2)色谱条件：选用色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈—水—磷酸(V乙腈∶V水∶V磷酸=15∶85∶0.1)，检测波长290 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL。

(3)对照品溶液的制备：精密称取12.0 mg二氢杨梅素置于25 mL容量瓶中，加少量甲醇，超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为48.0 μg/mL的对照品溶液，根据色谱条件，测定标准品溶液，记录其二氢杨梅素标准品色谱。

(4)进样操作：精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，进行计算。

1.3.3 浸膏得率测定 取提取液25 mL于干燥至恒重的蒸发皿，恒温水浴(90±5)℃蒸干，105 ℃下干燥3 h，干燥器中冷却30 min，称重后按(1)式计算浸膏得率。

(1)

式中：

C——浸膏得率，%；

m1——蒸发皿与提取液质量，g；

m2——蒸发皿质量，g；

m3——提取液蒸干、干燥后质量，g。

1.3.4 单因素试验

(1)提取次数对二氢杨梅素含量和浸膏得率的影响：称取药食同源材料组合65 g，加水浸泡1 h，加热回流提取3次，第1次加水体积为其质量的8倍提取1.5 h，第2次和第3次加水体积为其质量的6倍并提取1.0 h，提取结束后对提取液进行收集，共3份提取液。将3份提取液分别定容至1 000 mL且混合均匀后各取适量，液相色谱法测定二氢杨梅素提取量，并计算浸膏得率。

(2)浸泡时间对二氢杨梅素含量和浸膏得率的影响：准确称取药食同源材料65 g，加水浸泡0.5，1.0，1.5，2.0 h，加热回流提取2次，第1次加水体积为其质量的8倍提取1.5 h，第2次加水体积为其质量的6倍提取1.0 h，提取结束后对提取液进行收集，共3份提取液，将其定容至1 000 mL并混合均匀，液相色谱法测定二氢杨梅素提取量，并计算浸膏得率。

(3)加水量对二氢杨梅素含量和浸膏得率的影响：准确称取药食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加热回流提取2次，第1次加水体积分别为其质量的6，8，10，12倍提取1.5 h，第2次加水体积分别为其质量的4，6，8，10倍提取1.0 h，提取结束后对提取液进行收集，共3份提取液，将其定容至1 000 mL并混合均匀，液相色谱法测定二氢杨梅素提取量，并计算浸膏得率。

(4)提取时间对二氢杨梅素含量和浸膏得率的影响：准确称取药食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加热回流提取2次，第1次加水体积为其质量的8倍分别提取1.0，1.5，2.0，2.5 h，第2次加水体积为其质量的6倍分别提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取结束后对提取液进行收集，共3份提取液，将其定容至1 000 mL并混合均匀，液相色谱法测定二氢杨梅素提取量，并计算浸膏得率。

1.3.5 正交试验 采用L9(34)正交表，根据单因素试验结果，选择浸泡时间、加水量和提取时间为考察因素，考察指标为二氢杨梅素提取量和浸膏得率。

综合评分时需参考各指标的最大值，数据用归一化处理，在数据统计分析时需根据各指标影响作用大小分析不同权重，其公式为：

(2)

式中：

Z——综合评分；

M1——二氢杨梅素提取量，mg；

M2——最大二氢杨梅素提取量，mg；

C1——浸膏得率，%；

C2——最大浸膏得率，%。

1.3.6 数据处理与分析 采用SPSS 20.0软件与Ecxel软件对试验数据进行分析和处理，采用Origin 2019进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取次数 药食同源材料组合中二氢杨梅素易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，但因考虑到药食同源材料组合中各材料多为水煎，并考虑到安全性及未来可能会在婴幼儿产业中的应用采用热水提取。由表1可知，对65 g药食同源材料组合进行第1次提取时，二氢杨梅素提取量为2 910.26 mg，浸膏得率为17.40%；随着提取次数的增加，二氢杨梅素提取量从第2次的825.61 mg降为260.09 mg，浸膏得率从7.60%下降到4.10%。

表1 提取次数对提取效果的影响

提取次数对药食同源材料组合中二氢杨梅素提取量具有重要影响。二氢杨梅素提取量会随着提取次数的增加而升高，但第3次提取时二氢杨梅素提取量已明显低于前2次提取，原因可能是药食同源材料组合中二氢杨梅素的提取在前2次提取时已达饱和，可能热水并没有有机溶剂对植物细胞壁持续强穿透及活性物质溶解作用，导致其二氢杨梅素提取量不会因提取次数增加而过多变化，提取次数的增加虽会增加其提取量，但对后续提取效果已无显著影响，并无实际意义，反而增加成本和负担，故试验采取2次即可满足提取要求。

2.1.2 浸泡时间 由图1可以看出，随着浸泡时间的延长，65 g药食同源材料组合中二氢杨梅素提取量和浸膏得率有逐渐升高的趋势；二氢杨梅素提取量从2 565 mg增长为3 056 mg，浸膏得率从20.5%增长为25.8%；分析各阶段的增长率可知，二氢杨梅素提取量的增长率在逐渐变小，由8.97%减小至4.77%，而浸膏得率的增长率逐渐变大，由4.04%增加到11.02%。

图1 浸泡时间对提取效果的影响

二氢杨梅素提取量增加是因为随着浸泡时间的增加，药食同源组合材料会充分与热水接触，热水会对植物细胞壁造成破坏，从而导致二氢杨梅素的浸出；二氢杨梅素提取量的增长率降低是因为热水对植物细胞壁破坏效果有限，热水的破坏效果达到阈值，细胞内外二氢杨梅素提取量达到平衡，导致二氢杨梅素浸出的速率开始降低，所以二氢杨梅素提取量的增长率降低。浸膏得率升高是因为桑叶、菊花、麦芽、甘草与淡竹叶在热水条件下，二氢杨梅素浸出的同时其自身水溶性物质会因热水而浸出[28]，因此会使浸膏得率增加，故浸泡1.5 h即可满足要求。

2.1.3 加水量 由图2可以看出，65 g药食同源材料组合中二氢杨梅素提取量和浸膏得率随加水量的增加有逐渐升高的趋势，二氢杨梅素提取量从2 345 mg增长到3 498 mg，浸膏得率从22.5%增长到25.5%；此外，试验还发现，二氢杨梅素提取量的升高趋势比浸膏得率大，但二者的增长率却都在不断减小，前者由22.64%减小至4.32%，后者由6.67%减小至2.00%。因为随着加水量的增加，热水积温效果会使水温更好地维持在一定范围内，增加的热水量越多，水温下降速度越慢，所以在一定范围内增大加水量会有利于二氢杨梅素和一些水溶性物质的快速浸出，而且提取液中水溶性成分及杂质也会变多，但随着热水增加，料液比会逐渐升高，当加水量为10倍/8倍时，提取效果已不再明显。

图2 加水量对提取效果的影响

同时试验结果还表明，当加水量为6倍/4倍时，溶液黏度较高，或因料液比太低所致，且对二次提取产生不利影响。因此，加水量为10倍/8倍时即可满足要求。

2.1.4 提取时间 由图3可以看出，65 g药食同源材料组合中二氢杨梅素提取量随提取时间的延长而逐渐升高，提取量从2 635 mg增长到2 952 mg，二氢杨梅素提取量的增长率逐渐减小，由6.19%减小至1.37%；浸膏得率随提取时间的延长而逐渐升高，从21.5%增长到27.5%；浸膏得率的增长率随提取时间的延长基本保持一致，并无明显波动；二氢杨梅素提取量的增长率的降低一方面是因为随提取时间的延长，二氢杨梅素浸出后与热水接触时间变长，热水的高温导致二氢杨梅素发生氧化作用，导致其提取量降低；另一方面是随着提取时间变长，所得提取液会形成胶状溶液，导致其过滤及后续操作损失严重。因此需要选择合适提取时间。浸膏得率的增长率随提取时间的延长基本保持一致且无明显波动，是因为高温作用可以使水溶性物质逐步溶解浸出，弥补了提取时间延长过程中二氢杨梅素的氧化损失，所以浸膏得率也缓慢增大。因此，提取时间为1.5 h/1.0 h即可满足要求。

图3 提取时间对提取效果的影响

2.2 正交试验分析

根据单因素试验结果，选择浸泡时间、加水量和提取时间为考察因素，考察指标为二氢杨梅素提取量和浸膏得率。

试验采用L9(34)正交表，所选因素水平及试验结果见表2和表3。

表2 正交试验因素水平表

根据表3数据，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，各因素作用顺序为B(加水量)>A(浸泡时间)>C(提取时间)，得到最优方案为A1B3C2。

表3 正交试验设计及结果

表4方差分析结果表明：加水量的变化会影响二氢杨梅素提取量，且优于浸泡时间和提取时间，加水量对药食同源材料组合中二氢杨梅素的提取效果有显著影响(P<0.05)，浸泡时间和提取时间对提取效果无显著影响。因此，综合上述试验结果得到水提工艺的最优条件为A1B3C2，即药食同源材料组合加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水体积为其质量的10倍提取1.5 h，第2次加水体积为其质量的8倍提取1.0 h。

表4 方差分析结果†

称取3份65 g的药食同源材料组合，根据得到的正交试验最优选择对提取工艺条件进行验证。表5试验结果显示优选出的最佳方案A1B3C2具有良好的重现性，表明此提取工艺条件合理、稳定、可操作性强。

表5 验证实验结果

3 结论

采用热水浸提法提取药食同源材料组合藤茶中二氢杨梅素的最优条件为加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水体积为其质量的10倍提取1.5 h，第2次加水体积为其质量的8倍提取1.0 h。在此最佳条件下，65 g药食同源材料组合中二氢杨梅素提取量为3 761.14 mg，浸膏得率为31.42%，综合评分为99.47，该工艺可满足药食同源材料组合中二氢杨梅素的提取要求且大大提高提取效率。

试验弥补了过往只对单一物质材料研究提取的空白，而且热水浸提生产成本低，无有机溶剂残留，安全性高，药食同源材料中提取物大多为中药成分，可应用于婴幼儿辅助食品。在后续研究中应充分对药食同源材料的功能性和适用性进行深入研究，亦可根据不同应用领域探究适合的提取方法以及分离纯化，充分发挥药食同源材料这一宝贵的资源。