固本化瘀法对2型糖尿病大鼠足细胞损伤及信号通路的影响

陆 军，李 红

(1.山西省中西医结合医院药剂科，太原 030013；2.山西省中西医结合医院肾病二科，太原 030013)

糖尿病肾病是常见的糖尿病微血管并发症，也是终末期肾脏病常见的病因之一[1]，发病机制复杂且缺乏有效的防治手段。足细胞损伤是贯穿糖尿病肾病的病理环节，高糖及糖基化终末产物刺激、炎症及氧化应激反应激活等可造成肾病蛋白(nephrin)、足细胞蛋白(podocin)和CD2相关蛋白(CD2AP)等足细胞标志分子表达下调，进而造成足细胞损伤、肾小球滤过膜通透性增加并产生蛋白尿[2-4]。中医认为糖尿病肾病属于“消渴”、“尿浊”、“虚劳”范畴，病机总属本虚标实，本虚指脾肾亏虚，标实指痰湿血瘀，根据病机主张给予固本化瘀方进行治疗。相关细胞实验发现，固本化瘀法含药血清对高糖引起的足细胞损伤具有保护作用[5]；另有多囊卵巢综合征及胰岛素抵抗相关的研究证实，固本化瘀法能够促进大鼠体内磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)通路激活[6]。基于此，本研究将以2型糖尿病大鼠作为实验对象，观察固本化瘀法对大鼠足细胞损伤及PI3K/Akt通路的影响，旨在探究固本化瘀法在糖尿病肾病防治中的作用及机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 全自动生化分析仪(GE公司)；正置显微镜(Nikon公司)；荧光定量PCR仪(Bio-rad公司)；凝胶成像系统(上海天能公司)。

1.2试药 HE染色试剂盒(上海碧云天公司);RNA提取、cDNA第一链合成、荧光定量PCR试剂盒，均购自北京天根生化公司;p-PI3K和p-Akt一抗，均购自Abcam公司。固本化瘀方的药材包括鹿角胶、龟甲胶、枸杞、党参、淫羊 董、巴戟天、川断、当归、丹参、莪术、三棱、苍术、香附、胆 南星、茯苓、陈皮和半夏，由本院药剂科采购，按每毫升生药含量25、15、5 g制备浓煎药汁，待使用时进行稀释。

1.3动物 成年雄性SD大鼠，湖南嘉泰实验动物有限公司，体质量为180～200 g，动物实验许可证号：SCXK(湘) 2019-0003。

2 方法

2.1分组、造模及给药 将SD大鼠随机分为对照组、模型组及固本化瘀方低、中和高剂量组，每组各10只。对照组用普通饲料喂养，其余各组用高脂高糖饲料喂养；6周后禁食不禁水过夜，对照组一次性腹腔注射等体积溶媒，其余各组以65 mg·kg-1一次性腹腔注射10 g·L-1链脲佐菌素，1周后经尾静脉检测空腹血糖(FBG)≥11.1 nmol·L-1认为造模成功。造模成功后，固本化瘀方低、中、高剂量组分别给予含有22.1、44.2、88.4 g·kg-1生药的固本化瘀方药液灌胃，对照组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃，灌胃剂量为0.01 mL·g-1，每日1次，连续4周。

2.2生化指标检测 末次给药后将大鼠放入代谢笼、收集24 h尿液，采用生化分析仪检测尿微量白蛋白(mAlb)及尿肌酐(Ucr)，计算尿mAlb/Ucr；断头处死大鼠，立即收集血液样本5～6 mL，离心分离血清后采用生化分析仪检测FBG、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)。

2.3肾脏病理改变检测 处死大鼠后解剖肾脏组织适量，用体积分数为4%的多聚甲醛固定后制作4 μm病理切片，采用HE染色试剂盒进行染色后在显微镜下观察肾脏病理改变。

2.4足细胞标志分子mRNA表达检测 处死大鼠后解剖肾脏组织适量，采用RNA提取试剂盒分离提取组织中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒进行反转录实验、合成cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒进行PCR实验，对目的基因nephrin、podocin、CD2AP及内参基因β-actin进行扩增，反应体系为cDNA 2 μL、预混液 10 μL、10 μmol·L-1上游引物及下游引物各0.4 μL、去离子水补足至20.0 μL。完成PCR反应后生成反应的循环曲线、得到循环阈值(Ct)，以β-actin为内参，计算nephrin、podocin、CD2AP的mRNA表达水平。

2.5p-PI3K、p-Akt蛋白表达检测 处死大鼠后解剖肾脏组织适量，采用组织裂解液进行匀浆，提取组织蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取30 μg蛋白样本进行电泳以分离不同相对分子质量的蛋白，电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用体积分数5%脱脂牛奶在室温封闭PVDF膜1 h，用1∶1 000稀释的p-PI3K、p-Akt一抗或1∶5 000稀释的β-actin一抗在4 ℃孵育PVDF膜过夜，次日用1∶2 000稀释的二抗在室温孵育PVDF膜1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到p-PI3K、p-Akt及β-actin的条带及吸光值，以β-actin的吸光值为内参、计算p-PI3K及p-Akt的表达水平。

3 结果

3.1各组大鼠生化指标比较 与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均显著升高(P<0.05)；固本化瘀方低、中和高剂量组大鼠FBG与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均显著降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠生化指标比较

3.2各组大鼠肾脏病理改变比较 对照组大鼠肾脏组织结构清晰，肾小球形态正常；模型组大鼠肾脏内肾小球萎缩，洗膜及基底膜增厚，少量炎症细胞浸润；与模型组比较，低、中和高剂量组大鼠肾脏的病理改变明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理改变的比较 (HE染色)

3.3各组大鼠肾脏中足细胞标志分子mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，固本化瘀方低、中和高剂量组大鼠肾脏组织中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠肾脏中nephrin、podocin和CD2AP的比较

3.4各组大鼠肾脏中PI3K/Akt通路比较 与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织p-PI3K、p-Akt的表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，固本化瘀方低、中和高剂量组大鼠肾脏组织中p-PI3K、p-Akt的表达水平显著增加(P<0.05)，结果见图2和表3。

图2 各组大鼠肾脏中p-PI3K、p-Akt的电泳图

表3 各组大鼠肾脏中 p-PI3K、p-Akt的比较

4 讨论

足细胞是位于肾小球基底膜外侧的一种高度分化的终末细胞，参与肾小球滤过膜的构成，足细胞损伤贯穿糖尿病肾病的病程始终，减轻足细胞损伤也成为近年来防治糖尿病肾病的重要靶点[7-8]。足细胞中nephrin、podocin和CD2AP等分子参与构成足细胞裂隙膜，上述分子表达降低被视作足细胞损伤的标志[9-12]。本研究采用高脂高糖饲料喂养及链脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型，造模后检测到Scr、BUN和尿mAlb/Ucr水平升高，肾脏出现了典型的糖尿病肾病病理改变且nephrin、podocin和CD2AP的表达降低，表明2型糖尿病大鼠出现了肾功能损害及足细胞损伤。

根据中医理论，糖尿病肾病的发病与阴阳两虚、气滞血瘀有关，固本化瘀法能够通过益气养阴、活血化瘀、健脾固肾等发挥治疗糖尿病肾病的作用[13-14]。本研究在2型糖尿病大鼠造模后给予不同剂量固本化瘀方治疗，治疗后Scr、BUN、尿mAlb/Ucr水平均明显降低且肾脏病理改变明显减轻，表明固本化瘀方能够减轻2型糖尿病大鼠的肾脏损害。固本化瘀方相关的细胞实验证实，该方的含药血清能够减轻高糖引起的足细胞损伤，本研究观察固本化瘀方减轻2型糖尿病模型大鼠足细胞损伤的作用，结果显示,不同剂量固本化瘀方干预后，肾脏组织中nephrin、podocin和CD2AP的表达增加，与既往文献在离体细胞中的实验结果[5]吻合，表明固本化瘀方能减轻2型糖尿病大鼠的足细胞损伤。

足细胞损伤的发病机制复杂，且与PI3K/Akt通路和TGF-β/Smad通路的异常激活或抑制密切相关[15-17]。PI3K/Akt通路以磷酸化的形式发生激活，激活后具有促进细胞存活及增殖、抑制细胞凋亡的作用。相关的动物实验及细胞实验研究表明，糖尿病大鼠的肾脏组织中以及高糖处理的肾小球内皮细胞及足细胞中p-PI3K和p-Akt的表达水平降低[18-20]。本研究观察到2型糖尿病大鼠肾脏中p-PI3K、p-Akt的表达水平降低，与既往文献报道一致。固本化瘀方具有激活PI3K/Akt通路的作用，本研究在使用不同剂量固本化瘀方干预后观察到肾脏组织中p-PI3K和p-Akt的表达水平增加，表明固本化瘀方能够促进2型糖尿病大鼠肾脏组织中PI3K/Akt通路的激活，这也可能是固本化瘀方减轻肾脏病理改变及足细胞损伤的分子机制。

综上所述，2型糖尿病大鼠存在足细胞损伤的情况，由于激活PI3K/Akt通路是固本化瘀法减轻足细胞损伤的可能分子机制，固本化瘀方干预能够减轻2型糖尿病大鼠足细胞损伤，本研究为今后防治糖尿病肾病、减轻足细胞损伤提供了实验依据。