厚朴酚对H1N1流感病毒性肺炎防治作用的实验研究

周陈建，赵嫏嬛，吴晓宁

(1温州市中心医院药剂科·浙江 温州 32500；2温州市人民医院·浙江 温 325000；3杭州医学院·浙江 杭州 310053)

现代医学研究表明，流感病毒侵入呼吸道后，在黏膜上皮细胞内复制，刺激单核细胞、巨噬细胞分泌趋化因子和炎症蛋白等，激活Toll样受体7(TLR7)，通过TLR7介导的细胞内髓样分化因子88 (MyD88) 依赖和非依赖信号转导途径，诱导肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)、核因子-κB(NF-κB)和蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活化，从而产生IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子，引起一系列的炎症反应和免疫病理过程，最终导致呼吸器官的直接损伤[1-3]。厚朴主要含有厚朴酚(magnolol)、和厚朴酚(honokiol)等酚类物质，以及β-桉叶醇、聚伞花素等挥发性成分[4-5]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗抑郁和中枢抑制等作用，并对心脑血管、酶系统等均有影响[6-8]。本项目组在前期研究的基础上，以厚朴酚为研究对象，依托国家级抗流感病毒P3生物安全实验室，通过流感鼻腔攻毒建立感染小鼠病毒性肺炎模型，同时灌胃厚朴酚给予干预，探讨厚朴酚对H1N1所致病毒性肺炎的干预作用。

1 实验材料

1.1 病毒与动物 甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)。ICR小鼠，SPF级，体质量22～24 g，雄性，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(浙)2019-0002。本实验在浙江省实验动物中心ABSL2生物安全实验室中进行。

1.2 实验药物和试剂 厚朴酚：上海思友生物技术有限公司，批号：1908005；利巴韦林颗粒：四川百利药业有限责任公司，批号：180933。TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α兔多克隆抗体：美国Abcam公司。

1.3 实验仪器 ClassⅡTypeB2生物安全柜：美国Baker公司；VETEQUIP RC2型气体麻醉系统：美国VETEQUIP公司；SW-CJ-2FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；720BR/01492型凝胶成像系统：美国 Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 造模及分组给药 将60只ICR小鼠随机分成6组，分别为正常对照组、模型组、厚朴酚低剂量组(96 mg/kg)、中剂量组(192 mg/kg)、高剂量组(384 mg/kg)和阳性组(利巴韦林，180 mg/kg)，每组10只。实验从第1～7 天均需给药，给药组按组别灌胃给予相应药液0.4 mL，正常对照组和模型组小鼠灌胃给予0.4 mL纯净水，每天给药2 次。实验第3天各组小鼠经气体麻醉机麻醉，正常对照组小鼠滴鼻吸入30 μL生理盐水，其他5组小鼠滴鼻吸入等体积流感病毒液。实验第8天各组小鼠称重，处死，剖取肺组织称重，计算肺指数。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况

2.2.2 肺指数 实验第8天各组小鼠称重，处死，剖取肺组织称重，计算肺指数。

2.2.3 肺组织病理变化 摘眼球放血处死小鼠，取肺组织，以生理盐水洗净，立即投入 10% 中性福尔马林溶液中固定，乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，常规切片，HE 染色，在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病变情况。

2.2.4 Western blot 检测TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达 取适量肺组织，加细胞裂解液，提取蛋白。BCA 法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白质上样，经 12%SDS-PAGE 并转移至 PVDF 膜上，分别加入1∶1 000稀释的TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α抗体，4 ℃孵育过夜，以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)连接的二抗于室温孵育 1 h，ECL 观察结果。β-actin作为内参。

3 实验结果

3.1 各组小鼠一般情况 实验第5天可观察到感染小鼠出现毛色无光泽、耸毛，食欲减退，体质量开始减轻等流感发病症状，且模型组更加明显。

3.2 各组小鼠肺指数比较 解剖后相较于正常对照组，感染小鼠肺脏出现不同程度肿胀；正常组小鼠肺为粉红色，感染小鼠肺可见暗红色病变。模型对照组小鼠肺指数高于正常对照组，且具有显著差异(P<0.05)；各给药组小鼠肺指数虽然高于正常对照组，但均显著低于模型对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺指数比较

3.3 各组小鼠肺组织病理变化 HE染色可见：正常对照组肺组织肺泡排列均匀，结构完整，肺泡壁未见增厚，肺泡腔内无分泌物，未见炎性细胞浸润；模型组肺泡结构遭到破坏，大量炎性细胞浸润，肺泡壁明显增厚，偶见红细胞渗出；厚朴酚各剂量组肺泡均有不同程度损伤，肺泡壁不同程度增厚，炎性细胞不同程度浸润，但病变程度均较模型组轻。见图1

图1 各组小鼠肺组织病理变化观察(HE，×50)

3.4 各组小鼠肺组织TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α表达的Western blot检测结果

与正常对照组比较, 模型组 TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α表达显著增加, 除低剂量组、中剂量组对MyD88表达影响较小，其余各组TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α表达都有不同程度的降低。见图2。

图2 各组小鼠TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α表达的Western blot检测结果

4 讨论

前期研究发现，厚朴具有显著的抗流感病毒作用，不仅能显著抑制流感病毒在鸡胚尿囊液中的增殖，而且能有效改善流感病毒感染小鼠肺组织的病理状态，降低感染小鼠肺组织的病毒载量，降低肺组织NO水平，降低感染小鼠死亡率，延长平均生存时间，提高机体免疫水平，并结合GC-MS和HPLC分析，初步确定厚朴中酚类成分为其抗流感病毒有效成分，其中“厚朴酚”及“和厚朴酚”占总酚含量的98%[9]，初步阐明了其抗流感病毒药效物质基础。

李杰萍等[10]研究发现，厚朴酚对小鼠体内A23187引起的胸膜炎具有很好的抗炎疗效，在浓度10 mg/kg的剂量可减轻A23187引起的蛋白质泄漏，抑制分叶核白细胞的渗出，减少胸膜液体中的前列腺素和白三烯水平。本次研究显示，厚朴酚在96～384 mg/kg浓度范围内，各给药组小鼠肺指数虽然高于正常对照组，但均显著低于模型对照组(P<0.05)。病理HE染色结果及Western blot 实验显示，给药各组能减轻肺组织肺泡病变程度及降低TLR7、MyD88、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达。表明厚朴酚能抑制流感(H1N1)所致病毒性肺炎的炎症反应。

本次研究初步探讨了厚朴酚抗流感病毒性肺炎的分子信号转导机制，揭示厚朴酚对Toll炎症信号通路之间分子对话的作用机制，阐明厚朴酚的主要作用靶点和作用层次，为厚朴资源开发和利用及进一步研制出疗效确切的防流感中药制剂提供实验依据。同时希望对实现本省中药材种植产业化，促进中药材的开发，推动我省医药工业的发展，提高农民的收入，具有积极的作用。