UPLC-MS/MS测定棉铃虫体内丁布的残留量

李维政，宁忠雄，梁 赫，路 伟

(新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心/自治区农林有害生物监测与安全防控重点实验室，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】丁布是玉米、小麦等禾本科作物中特有的次生代谢物质(DIMBOA、2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-酮)[1，2]。棉铃虫是一种杂食性的害虫，玉米是新疆地区棉铃虫的重要寄主植物之一，运用丁布作为标记物，通过分析虫体内丁布的含量，对判断棉铃虫取食的寄主植物来源有实际意义。【前人研究进展】刘小红等[3]采取HPLC-MS方法测定多个玉米品种幼苗中丁布含量，丁布回收率大约为99.97%。宋鹏飞等[4]利用HPLC方法对多种在生产上已经推广使用的玉米品种检测丁布含量，11个玉米品种叶片中都含有丁布，但不同玉米品种之间丁布含量存在显著性差异。李晓辉等[5]利用高效液相色谱方法对各种玉米品类黄化苗进行了丁布含量检测，所有玉米品类黄化苗的丁布含量均显著。【本研究切入点】目前丁布残留分析的文献报道较少。目前丁布在虫体内的残留分析报道较少，多集中于玉米等禾本科植物样本中丁布的分析，新疆地区棉铃虫寄主植物主要有棉花、玉米、小麦等，小麦只有部分生长期与棉花重合，其作为庇护所的作用较为有限[6]。而玉米能够在时间和空间上为棉铃虫提供有效的产卵场所，能诱集棉铃虫成虫产大量的卵，成为最适宜的庇护所作物[7]。目前丁布残留分析的前处理步骤较为繁琐复杂，大多采用液相色谱法检测，检测虫体内的丁布含量需要灵敏度更高的仪器才能实现。研究对比2种前处理方法对丁布含量的影响。【拟解决的关键问题】比较2种不同的前处理方式，用Waters UPLC-MS/MS (Xevo TQS质谱)检测丁布的含量，建立一种UPLC-MS/MS测定棉铃虫体内丁布含量的分析方法，为丁布在快速残留分析提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

Waters的UPLC-MS/MS(Waters Xevo TQS质谱)，Xinyi-2020样品快速研磨仪(浙江宁波市新艺超声设备有限公司)、小型冷冻离心机、AL204型电子天平(德国梅特勒)、KQ5200DE型超声波仪(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

丁布标准品(98%，上海市吉至生化科技有限公司)；甲醇、甲酸、冰乙酸均为色谱纯(赛默飞世尔科技公司)，超纯水用Milli-Q IQ 7010超纯水仪(上海默克化工技术有限公司)制备，液氮。

供试棉铃虫饲养于新疆农业科学院植物保护研究所养虫室，每头棉铃虫样品分别装入1 mL离心管中，-20℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 提取

采取2种前处理方法提取，方法1参考Glauser等[8]，方法2参考张晓影等[9]。

方法1：将棉铃虫样品去除翅膀，在盛有液氮研钵中将虫体研磨成粉末，研磨期间要保证研钵中有液氮，研钵需提前预冷。将棉铃虫粉末转移到2 mL离心管中，加入2 mL含有0.5%甲酸的甲醇-水(50∶49.5，v/v)提取液，充分涡旋震荡，每个离心管中放入10个直径为1 mm的钢珠，使用数字研磨仪30 Hz下提取2 min。样品在4℃条件下14 000 r/min离心4 min，移液枪将上清液转移到新的离心管，用甲醇定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，贮存于HPLC棕色进样瓶中，-20℃保存。

方法2：将棉铃虫样品去除翅膀，在盛有液氮的研钵中将虫体研磨成粉末，研磨期间要保证研钵中有液氮，研钵需提前预冷。将棉铃虫粉末转移到2 mL离心管中，每管加入500 μL甲醇，室温下超声提取30 min后，样品在4℃条件下14 000 r/min离心4 min，移液枪将上清液转移到新的离心管，在残渣中再加入500 μL提取液，4℃条件下14 000 r/min离心4 min，合并2次离心的上清液，用甲醇定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，贮存于HPLC棕色进样瓶中，-20℃保存。

1.2.2 丁布系列浓度溶液的配制

准确称取丁布标准品，用色谱纯甲醇配制成10 mg/L标准溶液，用色谱纯甲醇逐级稀释为5、10、20、50、100 μg/L 5个梯度浓度的标准溶液。

将5、10、20、50、100 μg/L 5个梯度浓度的标准溶液按照色谱质谱条件检测，以仪器响应值的峰面积为纵坐标，丁布的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算丁布的线性回归方程。

采用标准添加法，在不含丁布的棉铃虫空白样品中，添加5、50 μg/L两种浓度的丁布标准溶液，每个浓度重复5次，测定丁布添加回收率。

1.2.3 色谱质谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50 mm、1.7 μm)。采用Waters UPLC-MS/MS (Waters Xevo TQS质谱)，电喷雾离子化源(ESI)、多重反应模式(MRM)，正喷雾模式进行测定。流动相A为纯水(含0.5%冰乙酸)，B为甲醇。脱溶剂气温度和流速为650℃和800 L/Hr；毛细管电压为3.0 kV。表1，表2

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

表2 丁布多重反应监测条件(MRM)Table 2 Multiple reaction monitoring conditions of DIMBOA

2 结果与分析

2.1 标准曲线和线性关系

研究表明，在5～100 μg/L质量浓度范围内，丁布的峰面积(y)与浓度(x)线性关系，回归方程为y=283.435x+121.274，相关系数r为0.999 1。表3，图1

2.2 准确度和精密度比较

研究表明，在5 μg/L添加水平下，2种方法棉铃虫样品中丁布的平均添加回收率分别为52.32%±7.67%、84.26%±2.70%。在50 μg/L添加水平下，2种方法的平均添加回收率分别为29.38%±4.65%、96.78%±9.12%。方法2准确度和精密度优于方法1，丁布峰型及响应值均较好，最低检测浓度为5 μg/L。图2，表3

表3 棉铃虫体内丁布添加回收率Table 3 Recovery rate of DIMBOA in Helicoverpa armigera

3 讨 论

Larsen等[10]采用丙酮提取玉米幼苗中的丁布，样品需低温冷冻、匀浆混合，再添加Amberlite XAD-7非离子聚合吸附剂，再用大量丙酮淋洗，洗脱液旋转蒸发后用二氯甲烷定容，该方法的提取步骤繁琐、时间较长。刘保川等[11]用乙醚萃取法提取玉米苗中的丁布，3次萃取后还需要用氯仿-甲醇(95∶5，v/v)、纯氯仿等多步重结晶来分离丁布，纯化步骤较多。刘小红等[3]用匀浆机将玉米苗捣碎，用无水乙醚将提取液萃取3次，再分别用无水硫酸钠和和无水氯化钙除去丁布提取液中残余水分，浓缩蒸干后用甲醇定容。李晓辉等[5]在玉米苗样品中加少许蒸馏水匀浆，用0.1 mol/L磷酸溶液酸化，将酸化液12 000 r/min离心15 min，上清液用乙醚萃取多次后旋蒸，甲醇定容。Li等[12]简化了前人的提取步骤，将玉米苗冷冻磨碎，用乙酸乙酯溶液直接萃取，将有机箱蒸干，残余物用丙酮-己烷混合溶液重结晶后，即可得到丁布。

Glauser等[8]和张晓影等[9]2种前处理方法提取丁布，添加回收率实验表明，发现方法2(甲醇超声提取)优于方法1(甲醇-水混合溶液振荡提取)，在5、50 μg/L 2个添加水平下，方法1的添加回收率均小于70%，方法2在2个水平下的添加回收率分别为在50 μg/L添加水平下，甲醇超声提取法的平均添加回收率分别为84.26%、96.78%，符合化合物残留分析的要求。方法2丁布峰型及响应值均较好，灵敏度优于HPLC的最低检测浓度。

4 结 论

对比甲醇超声提取和甲醇-水混合溶液振荡提取丁布的方法，甲醇超声提取法的添加回收率均介于80.42%～110.13%，满足化合物残留分析的要求。棉铃虫样品在低浓度5 μg/L、高浓度50 μg/L 2个添加水平下，甲醇超声提取法的添加回收率最佳，平均添加回收率分别为84.26%、96.78%，最低检测质量浓度为5 μg/L。前处理方法安全、便捷、快速，检测方法稳定、分离效果高。