基于土壤碳循环的丹参连作障碍机制研究△

崔宁，陈为序，李琦，李西文

1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；4.上药华宇（临沂）中药资源有限公司，山东 临沂 276000；5.上海市药材有限公司，上海 200002

连作障碍指连茬种植同一种或同一科植物，即使在正常的管理条件下，也会出现长势变弱、产量降低、品质下降、病虫害加重的现象[1]。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈功效，用于治疗胸痹心痛、脘腹胁痛、癥瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛等疾病[2]，已有近2000 年的临床应用历史。近年来，随着心脑血管疾病发病率上升，丹参市场需求不断增加[3]，但野生丹参供给量远远不能满足市场需求。目前，丹参药材多以栽培为主。在丹参人工种植过程中，连作障碍现象十分严重[4]。连作丹参长势明显减弱，根内部木质化、生长畸形，常伴有裂根等现象[5]。连作2 年丹参地下部鲜质量下降56.5%，干质量下降54.2%；根脂溶性成分二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量分别下降35.3%、32.3%、19.4%、3.4%；水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B分别下降66.9%和64.4%[6]。连作对高品质丹参药材的生产造成极大影响。因此，揭示连作障碍机制，进而解决丹参连作障碍问题刻不容缓。

丹参连作障碍机制研究主要包括土壤理化性质改变[7]、化感自毒作用[8]及土壤微生物种群失衡[9]3 个方面，均从丹参生长环境变化的角度阐释连作障碍机制，未包括丹参自身生理生长的影响，未从根本上揭示连作引起局部生态系统从正常动态偏离的复杂自适应现象。因此，迫切需要从新的角度剖析连作障碍现象，为丹参大规模连续种植提供技术支撑。

目前，连作障碍研究主要关注点在植物根系细胞的数量及土壤微生物的丰度，忽视了两者的新陈代谢活力。然而，根系细胞及土壤微生物活性的高低能够指示植物自身、植物与土壤之间及土壤内部物质代谢的旺盛程度，可以作为衡量土壤质量状况、维持土壤肥力和药材品质形成的一个重要指标，对维持药用植物根际微生态系统功能具有重要作用。因此，可尝试从连作对植物及土壤物质代谢抑制作用角度揭示连作障碍发生机制。

土壤呼吸指土壤释放二氧化碳的过程，主要由微生物氧化有机物（异养呼吸）和根系呼吸（自养呼吸）产生。连作障碍本质是单一种群的连续种植对土壤的理化性质和微生物群落产生了影响，可以通过测定土壤呼吸间接反映根系细胞/土壤微生物活力水平，进而推测丹参与连作土壤之间的相互负反馈情况。开路式土壤碳通量测量系统可以测定碳通量及土壤呼吸速率，在土壤碳循环研究中广泛应用[10-11]。本研究通过测定不同连作年限丹参根际微生态系统土壤碳通量，探索连作对土壤呼吸的影响，从土壤呼吸角度阐释连作障碍现象，为后续连作障碍问题解决提供新思路。

1 材料

样品经中国中医科学院中药研究所李西文副研究员鉴定为1～5 年生唇形科鼠尾草属丹参Salvia miltiorrhizaBge.植株。碳通量检测采用LI-8100 型土壤碳通量自动测量系统（美国LI-COR公司）。

2 方法

2.1 试验设计

本研究试验地点位于山东省临沂市平邑县上药华宇（临沂）中药资源有限公司丹参基地。该地区平均年降水量707～759 mm，年平均气温13.5～14.0 ℃，年均相对湿度58.3%～59.8%，年平均日照153.7～254.4 W·m-2，土壤类型为低活性淋溶土，适宜丹参生长。

2019 年3 月，分别于空白地块（前茬未种丹参）及连续种植丹参1～3 年样地（各样地丹参生长周期均为1 年）起垄，样地种植丹参，种植参数相同。后经相同田间管理，于2019年11月测定空白及丹参连作地块的土壤样品。选择连续气温及空气湿度相对稳定的5 d，采用土壤碳通量自动测量系统测定空白及丹参不同连作年限地块的土壤总呼吸。每个地块于测定前1 d 随机选择36 个丹参植株，去除丹参地上部分及杂草，布置内径20 cm 的土壤环，每个土壤环上缘露出地表2～3 cm。从7:00—17:00，每2 h 测定6 个土壤环，每个土壤环连续测定3 次。空白地块于垄上直接随机选点测定。系统设定参数为：Obs.Length 1:30，Dead Band 20 s，Obs.Count 3，Pre-Purge 15 s，Post-Purge 15 s。系统配置的温度探针和水分传感器即时测量地表下10 cm 处土壤温度及湿度。

2.2 数据分析

采用SPSS 23.0 统计软件对各地块碳通量及温湿度数据进行描述性统计、比较并作箱式图；Microsoft Excel 2016 做柱状图及折线图；R v.3.6.3软件stats 包中prcomp 函数对各测量点的碳通量和土壤温湿度数据进行主成分分析（PCA），并用ggplot2 包中ggplot 函数进行绘图。

3 结果

3.1 土壤碳通量及土壤呼吸速率日变化特征

由图1 可知，丹参不同连作年限地块土壤呼吸速率日变化曲线均呈单峰，且变化趋势一致，从7:00 开始，土壤呼吸速率随着时间的推移逐渐增加，最高值均出现在13:00，随后逐渐下降。除连作4 年地块（图1E）外，各地块碳通量最低值均出现在7:00。

图1 丹参根部土壤呼吸速率日变化曲线

3.2 丹参不同连作年限地块土壤呼吸速率

如图2所示，丹参种植1年和连作2年地块土壤碳通量较高，均值分别为0.696 3、0.728 5 μmol·m-2·s-1，两者之间差异无统计学意义；连作3 年地块碳通量稍低，均值为0.603 2 μmol·m-2·s-1，与连作2 年地块间差异有统计学意义（P<0.01）；连作4 年丹参地块碳通量最小，均值为0.504 1 μmol·m-2·s-1，与连作3 年地块间差异有统计学意义（P<0.05）；空白地块土壤呼吸速率比各连作地块低，碳通量均值为0.329 1 μmol·m-2·s-1，与其他地块差异有统计学意义（P<0.001）。

图2 丹参根部土壤碳通量比较

3.3 丹参不同连作年限地块土壤温湿度比较

3.3.1 土壤温度的比较 丹参不同连作年限地块土壤温度日变化曲线趋势基本一致（图3）。除连作2 年地块外，7:00—17:00 土壤温度先降低后升高，最低值出现在9:00。统计分析发现，连续测定的5 d 内，不同连作年限地块土壤温度间差异无统计学意义（F=2.484）。

图3 丹参根部土壤温度日变化曲线

3.3.2 土壤湿度的比较 由图4 可知，不同连作年限地块土壤湿度间差异有统计学意义（F=18.785，P<0.01）。土壤湿度大小顺序为连作1 年地块（0.083 96 m3·m-3）>2年地块（0.08140m3·m-3）>4年地块（0.056 00 m3·m-3）>3年地块（0.041 22 m3·m-3）>空白地块（0.033 00 m3·m-3）。其中，连作1 年地块与连作2 年地块之间土壤湿度差异无统计学意义，连作3年、4年与空白地块之间土壤湿度差异无统计学意义，连作2 年地块与4 年地块差异有统计学意义（P<0.01）。

图4 丹参根部土壤湿度（,n=36）

3.4 PCA

如图5 所示PC1（贡献率40.20%）主要由土壤湿度（pca_loadings 值0.707 4）及碳通量（pca_loadings 值0.672 0）组成。PC2（贡献率33.34%）主要由土壤温度（pca_loadings值-0.950 1）组成。根据样点重合率可将5 个地块分为3 组：连作1 年、2 年地块组，连作3 年、4 年地块组和空白地块组。数据显示，连作1年与2年地块之间、连作3年与4年地块之间土壤相似度较高。由于主要依靠PCA1将样点粗略分为3 组，说明连作地块的主要差异因素为碳通量和土壤湿度。

图5 丹参不同连作年限地块PCA结果

4 讨论

4.1 连作对土壤呼吸速率及土壤温度、湿度的影响

4.1.1 连作对土壤呼吸速率的影响 土壤呼吸是指土壤释放二氧化碳的过程，主要由生物氧化有机物和根系呼吸产生，另有极少部分是土壤动物和化学氧化释放。土壤呼吸是一种复杂的生物学过程，受到多种因素的影响，如土壤温度[12]、土壤含水量[12]、降水[13]、凋落物、土地利用方式[14]及土壤碳、氮含量等非生物因子等。其中，土地利用方式对土壤呼吸的影响主要是通过改变植被覆盖和土壤性质实现[15]。植被覆盖的改变可以影响土壤表层的能量平衡和近地层的空气相对湿度。在植物根系作用下，土壤性质的改变一方面可以反作用于植物根系，另一方面对土壤微生物也会产生极大的影响。同种或同科植物连茬种植后，即使在正常的栽培管理条件下，也多会造成植株矮小、长势变弱、土壤植被覆盖度变小；连作还易造成土壤理化性质恶化、pH 降低、有机质含量降低、土壤次生盐渍化等，从而对植物根系及土壤微生物产生抑制作用[16]。因此，土地利用方式与连作因素对土壤呼吸的作用方式相似。基于此，课题组考察了连作对土壤呼吸的影响，将土壤呼吸相关测定技术应用到药用植物研究领域，为揭示连作障碍发生机制提供了新思路。

丹参根部土壤呼吸速率在丹参种植前2 年差异不大，但随种植年限增加而显著降低。从土壤生态环境角度来看，目前丹参主产区种植2 年后采收是适当的。此外，连作土壤呼吸速率下降、根系细胞及根际微生物物质代谢活性降低与连作导致丹参药材多项指标下降一致，如连作丹参根变细、根长减小、根质量下降、产量降低、商品率下降等。丹参1 个种植周期后，需要开展轮作或进行土壤改良。空白地块的碳通量数值最低，可能是由于空白地块未种植丹参，土壤微生物缺乏根系分泌的营养物质，在微生物丰度、多样性及代谢活性等方面与丹参种植地块产生差异所致。

4.1.2 连作对土壤温度、湿度的影响 本研究中，不同连作年限地块的土壤温度差异无统计学意义，说明在测定时间范围内，丹参连作对土壤温度未造成影响。且在测量时间内与其他地块相比，空白地块的温度变化幅度最大，9:00 后升温速率最快，推测其原因是空白地块缺少丹参植株覆盖。各地块土壤湿度存在差异，大小顺序为连作1年和连作2年地块>连作4 年和连作3 年地块>空白地块。随着连作年限增加，土壤湿度逐渐减小。这种规律可能是由连作对丹参植株的间接抑制作用产生。丹参在整个生长时期不断向环境中释放代谢产物。连续种植，代谢产物积累，达到限度后迫使土壤微生物组群落结构功能调整，异养呼吸发生变化。在此环境下，丹参植株的各项生长发育活动被抑制，根系自养呼吸减弱、持水能力减弱，最终造成土壤湿度降低。同时，土壤含水量降低、易缺水干旱，又会反过来胁迫连作丹参，抑制其生长。

4.2 “土壤碳循环减弱”导致丹参连作障碍的科学假设

目前，植物连作障碍机制研究主要包括3 个方面：土壤理化性质恶化[17]、化感自毒作用[18]及土壤微生物种群失衡[19]。基本内涵分别包括：1）土壤理化性质恶化机制。连作会造成土壤酸化，土壤养分有效性改变，进而影响植物生长与发育。2）化感自毒作用机制。大多数植物具有自毒作用，植物可以通过多种途径释放自毒物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用。一种植物化感自毒物质通常含有多种成分，以混合物形式作用于周围环境及植物体[20]。3）土壤微生物种群失衡机制。连作使土壤中微生物种群结构变化、菌群多样性改变、有益菌减少、有害菌增多、土壤生态功能紊乱，进而造成连作障碍。然而，以上3 种机制均无法全面揭示植物连作障碍现象本质。其中，土壤理化性质恶化机制究其根本应为植物和（或）微生物对环境的响应，并非主动改变。植物化感自毒作用机制因受目前科技水平限制，无法系统考察一种植物的所有自毒物质[21]，也就无法进行准确的机制内涵诠释和有效验证。根际微生物失衡机制研究受数据库和人工培养技术限制，无法准确定义连作相关核心微生物种群，也无法进行有效的结果验证[22]。

目前，丹参的连作障碍发生机制不明确，且与整个植物学相比，其机制基础研究相对滞后。研究表明，丹参连作使土壤pH 降低[23]，头茬到四茬土壤pH 由8.02 降至7.32[24]，土壤中多种酶活性降低[25]，其他土壤理化指标变化研究较少，且关于丹参化感自毒物质的研究尚无报道。丹参须根腐解可造成多种物质累积水平增加[26]，但对增加的腐解产物需进行效应验证。经过短期连作土壤扩增子测序分析发现，丹参连作使根际土壤细菌数量减少[27]，真菌数量增加[28]，功能微生物群落数目改变，多样性指数减小，但未有长期的跟踪研究报道。

本研究表明，丹参连作使根际微生态系统土壤呼吸减弱，说明连作在减少根系细胞数量（体现在连作丹参根部萎缩、变细、变短及根质量减少等）、改变根际微生物相对丰度及多样性的同时，对土壤碳循环过程也具有抑制作用。土壤呼吸速率变化是丹参根和根际微生物的整体表现。在此基础上，本课题组提出丹参连作障碍机制“土壤碳循环减弱”的科学假设，即连作丹参代谢产物大量积累造成根际微生态系统碳循环减慢，进而抑制丹参根系生长发育，改变根际微生物组结构，造成土壤微环境变化。该假设与原有3 种机制相比，把丹参根部生理现象与环境变化很好地结合起来，而不是把生态环境因素单独处理，相关验证研究正在进行中。本研究从土壤微生态系统碳循环的角度揭示丹参连作障碍现象，为进一步解决连作障碍问题提供思路。