结直肠癌组织Rab27A的表达及意义

俞士勇， 彭 欢， 王化恺， 骆 洋， 项洪刚*

1.上海市浦东新区人民医院普通外科，上海 201299 2.上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科，上海 200127

结直肠癌发病率及致死率在全球居高不下[1]。早期结直肠癌患者多无特殊症状，或仅有腹痛、排便习惯改变等非特异性表现。多数患者确诊时已为进展期或晚期，而进展期结直肠癌患者术后由于易复发和转移，预后相对较差[2]。因此，探索结直肠癌患者的早期诊断和预后判断十分重要。临床上主要通过影像学检查、消化内镜及病理检查诊断结直肠肿瘤，而分子标志物应用相对较少。借助分子基因技术，在微观层面上研究结直肠癌的发生发展越来越被重视。

Rab蛋白是小GTP蛋白酶，其相对分子量为20 000～30 000，存在于大多真核细胞内与膜相关细胞器中[3]。Rab27是Rab蛋白主要的成员之一，包含2种亚型，分别为Rab27A和Rab27B[4]。研究[5]表明，Rab27A在机体中主要作用是帮助运输小泡聚集和靠近靶膜，进而导致外泌体释放。细胞内的Rab27A异常表达可促进癌症的发生及增加远处转移机会。例如Rab27A可促进乳腺癌的发生[6]，其过度表达与胃癌和卵巢癌的发生和转移也密切相关[7]。目前认为，Rab27A的表达异常在癌症发生发展过程中起重要作用。然而，国内有关Rab27A在结直肠癌中作用的报道尚不多见。

本研究通过比较Rab27A mRNA和蛋白在结直肠癌组织和正常组织间表达水平的差异，同时分析Rab27A表达与结直肠癌患者临床病理资料的相关性及Rab27A与结直肠癌患者预后的关系，探讨其在结直肠癌诊治中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2005年1月至2019年1月在上海市浦东新区人民医院普通外科和上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科接受手术治疗的125例结直肠癌患者的结直肠癌组织标本及临床病理资料。患者在手术前未接受新辅助化疗或其他针对肿瘤的治疗，均经病理组织学检查确诊。本研究经浦东新区人民医院伦理委员会和仁济医院伦理委员会审核批准(prylz 2020-008)，所有患者均知情同意。

1.2 实验试剂 TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒及qPCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。Rab27A抗体购自英国Abcam公司，GAPDH和山羊多克隆抗兔IgG购自美国Proteintech公司。

1.3 实时定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol试剂盒从组织中提取RNA，根据GeneAmp PCR System 9600的说明书，逆转录总RNA成cDNA。逆转录条件：37℃，15 min；85℃，5 s。Rab27A引物：正义链5’-GAA GCC ATA GCA CTC GCA GAG-3’，反义链5’-ATG ACC ATT TGA TCG CAC CA-3’；内参GAPDH引物：正义链5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’，反义链5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。数据分析采用2-ΔΔCT法。以上实验进行3次，取均值。

1.4 Western印迹法 结直肠癌组织和癌旁组织样品中加入适量的裂解液，低温离心10 min后获取目标蛋白。将目标蛋白与蛋白上样缓冲液混合，100℃金属浴5 min，冷却后即可上样。上样结束后电泳90 min，转膜，封闭，孵育一抗(Rab27A, Abcam公司, 1∶1 000)。4℃过夜，第2天孵育二抗60 min。PVDF膜上均匀滴加适量发光液，ECL底物发光。

1.5 免疫组化 组织切片经二甲苯脱蜡，水化，梯度乙醇脱水后，用0.3%过氧化氢孵育15 min，微波修复15 min，自然冷却后10%牛血清白蛋白封闭30 min，滴加PBS稀释过的Rab27A抗体(1∶200)，4℃过夜，HRP标记的二抗孵育30 min，在显微镜下进行DAB显色。最后苏木精复染，中性树胶封片。Rab27A染色阳性表现为棕黄色或棕褐色颗粒，主要位于细胞质中。光镜下随机观察10个高倍镜视野，记录1 000个肿瘤细胞中阳性细胞百分比，结合着色强度，按照表1的方式进行半定量评分：每个肿瘤细胞最后得分为两项乘积，小于4分为Rab27A低表达，大于或等于4分为Rab27A高表达。

表1 免疫组化染色计分标准

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0进行数据处理。采用t检验比较结直肠癌组织mRNA水平；采用χ2检验比较Rab27A表达水平与临床病理数据相关性；采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验比较Rab27A与结直肠癌生存率的关系。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 结直肠癌组织及癌旁组织中Rab27A mRNA和蛋白表达水平差异 选取32对结直肠癌肿瘤组织和相应的癌旁组织进行qRT-PCR实验，结果(图1A)显示，结直肠癌肿瘤组织中Rab27A mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(P=0.001)。随机选取其中8对结直肠癌肿瘤组织和癌旁组织进行Western印迹实验，结果(图1B)表明，结直肠癌肿瘤组织中Rab27A蛋白表达水平明显高于癌旁组织。上述结果表明，Rab27A mRNA水平和蛋白水平在结直肠癌细胞中均为高表达。

图1 Rab27A mRNA和蛋白在结直肠癌肿瘤组和癌旁组织织中的表达情况

2.2 结直肠癌组织中Rab27A表达水平与临床特点的关系 结果(图2)显示：Rab27A蛋白主要表达于细胞质中，在细胞核中也少许表达；Rab27A在肿瘤组织中表达水平明显高于癌旁组织。根据表1对Rab27A的表达进行评分，根据评分结果分为Rab27A高表达组(n=76)和Rab27A低表达组(n=49)。结果(表2)显示，肿瘤大小和临床分期在两组中差异均有统计学意义(P=0.037，P=0.017)，而患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及CEA水平在两组中差异无统计学意义。

图2 采用免疫组化检测Rab27A在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达水平

表2 Rab27A高表达组与低表达组患者的临床病理特点比较 n(%)

续表

2.3 Rab27A与结直肠癌患者预后的关系 结果(图3)表明：Rab27A表达水平与结直肠癌患者预后可能存在相关性，即Rab27A表达水平越高，患者生存期越短。单因素分析结果(表3)表明，Rab27A表达水平、肿瘤大小及临床分期与结直肠癌患者预后有相关性。多因素分析结果(表3)表明，Rab27A或可作为结直肠癌患者预后独立预测分子标志物。

图3 Rab27A表达水平与结直肠癌患者生存率关系

表3 结直肠癌患者预后单因素和多因素分析 n=125

3 讨 论

以Rab家族为代表的经典小GTP蛋白在机体正常的信号转导过程中扮演重要角色。Rab家族通过在GDP结合的非激活状态与GTP结合的激活状态之间的转化，参与调控正常的生物学功能[8]。有研究[9-10]显示，Rab家族在肿瘤发生发展过程中同样起着至关重要的作用，例如Rab25可通过激活Akt/GSK-3β信号通路介导上皮细胞和间叶细胞的转化，增强胃癌细胞的侵袭能力[9]；Rab25在卵巢癌患者肿瘤组织中表达量越高，患者术后预后越差；Rab25也可作为卵巢癌术后患者的预后预测分子[10]。Rab5与胞膜上的整合素相互作用促进膜内骨架蛋白形成细胞伪足，同时肿瘤细胞提高金属基质蛋白酶(MMP)9、MMP2等分子的分泌，加快细胞外基质的溶解，加快肿瘤细胞的扩散[11]。乳腺癌细胞中Rab8和Rab7有助于膜型金属蛋白酶1(MT1-MMP)的分泌，而Rab7的显性失活损害乳腺癌细胞迁移和侵袭能力[12]。

研究[13]表明，Rab27A在囊泡运输过程中，特别是细胞外泌体的形成和分泌中发挥重要作用。外泌体在肿瘤细胞的增殖和迁移中作用显著[14]，且是理想的肿瘤抗原标志。因此干扰Rab27A的表达可影响外泌体的分泌和生物功能，进而影响肿瘤的发生发展。Wang等[15]指出，Rab27A在胰腺癌细胞中表达水平异常升高，且表达量越高，患者预后越差，提示其可作为胰腺癌预后的预测分子。另有研究[16]指出，Rab27A通过促进胰岛素样生长因子2(IGF-2)的分泌，可增强乳腺癌细胞侵袭和远处转移能力，使乳腺癌患者预后更差。Chang等[17]指出，miRNA-134-3能通过降低Rab27A的表达来抑制卵巢癌细胞的增殖和周期，从而抑制肿瘤细胞的发生。Rab27A还与血管生成相关，抑制其表达会降低血管内皮生长因子受体1(VEGF-1)的棕榈酰化，从而减弱VEGF-1稳定性，使血管新生增加[18]。

本研究发现结直肠癌组织中Rab27A mRNA和蛋白较癌旁正常组织表达明显增高。免疫组织化学法结果也提示结直肠癌组织中存在Rab27A高表达现象。Rab27A蛋白与结直肠癌临床分期及肿瘤大小正相关，提示Rab27A可能参与肿瘤的分化及生长过程。单因素分析表明，Rab27A表达水平升高与结直肠癌总体生存期相关；多因素分析表明，Rab27A的表达水平升高是结直肠癌的危险因素，提示在结直肠癌诊断治疗中，Rab27A可作为一种新的潜在预后标志物。

本研究存在一定局限性：病例数所限，且常规将肿瘤临床分期分2组进行初步比较，而Ⅳ期肿瘤与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肿瘤的在生物学行为、诊断、治疗及预后等多有不同，未来将对此进行改进。

综上所述，本研究表明，Rab27A与结肠直肠癌发生发展有较强相关性，可作为潜在预后预测分子进行深入研究，或可成为结直肠癌诊治的一个新靶点。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。