貂源肺炎克雷伯菌分离鉴定与耐药性检测

郭 蕊 张召兴 曹丽辉 高桂生 史秋梅*

(1.河北省昌黎县农业农村局，秦皇岛，066000；2.河北旅游职业学院畜牧兽医系，承德，067000；3.河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛，066000；4.河北省唐山市第六十二中学，唐山，063000)

水貂(Neovisonvison)原产地是加拿大和美国，属鼬科(Mustelidae)，鼬属，被列入中国濒危与保护动物数据库。从20世纪五六十年代，我国的水貂养殖开始发展，80年代从北美引进黑貂品种(American sable)，后来从美国引进短毛黑貂(Standard mink)，目前我国水貂养殖品种以短毛黑貂为主，主要在我国的东北地区和华北地区饲养[1]。水貂的出血性肺炎是临床中主要疾病之一，其感染率和死亡率均较高，且疫情日趋严重[2]。引起水貂出血性肺炎的病原菌主要有肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)等，其中肺炎克雷伯菌也是引起狐(Vulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)等毛皮动物出血性肺炎的主要病原菌[3]。肺炎克雷伯菌属于条件致病菌，广泛分布于自然界中，主要存在于动物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，该菌从禽类、哺乳动物、鱼类等多种动物的体内分离得到，同时该菌也可以致人感染发病，为临床中重要的人畜共患病之一[4-6]。因此，肺炎克雷伯菌作为人兽共患病的病原应当引起重视。

近年来，临床中主要用抗生素治疗克雷伯菌水貂肺炎，常用的抗生素种类主要包括头孢菌素类、喹诺酮类、林可霉素类、酰胺醇类及大环内脂类等[7]。但由于不合理地使用导致高致病性、高水平多重耐药肺炎克雷伯菌菌株不断出现，不仅给养殖业造成严重的经济损失，同时威胁公共卫生安全[8]。本研究从秦皇岛地区水貂养殖场，采集患出血性肺炎貂的病料组织，进行致病性和耐药性检测，旨在为水貂肺炎克雷伯菌病防控及临床指导用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2018—2019年，从秦皇岛地区水貂养殖场，采集患出血性肺炎貂的肺脏、心血、肝脏等病料组织86份。

1.2 试验动物

22 g左右昆明系小鼠，由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.3 细菌分离培养

将患出血性肺炎貂的肺脏、心血、肝脏等病料组织接种于普通营养琼脂平板上，37℃恒温培养12—18 h后，接种于鉴别培养基——麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂(MIAC)平板上，37℃培养12—18 h，挑MIAC平板的单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养后，进行染色镜检、显微镜形态观察。

1.4 生化试验

按照Raid ID 32 E阴性菌鉴定试条说明书，调整菌液浓度为0.5个麦氏浊度，接种于阴性菌生化鉴定条，37℃培养12—24 h后进行生化鉴定。

1.5 引物设计

参照张聪等[9]的方法，根据GenBank中登录的肺炎克雷伯菌khe基因序列(CP035202.1)设计肺炎克雷伯菌鉴定引物P1，5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；P2，5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′，引物由上海生工生物工程股份公司合成。

1.6 细菌的PCR鉴定

按照基因组DNA试剂盒提取说明书，提取分离菌株的DNA，用肺炎克雷伯菌khe基因引物进行PCR检测，PCR产物送上海生工测序，其测序结果用Blast软件与GenBank中登录序列进行同源性比对，同源性≥99.0%，可以定义到种的水平；同源性为97.0%—98.9%，可以定义到属的水平；同源性<97.0%，则定义为科水平。

1.7 动物攻毒试验

参考文献中的方法[9-10]，对分离菌株培养至对数期用平板计数法计数，调整菌株浓度，每株分离菌株用于5只小白鼠的腹腔注射，剂量为0.2 mL(108cfu/mL)，对照组注射等量无菌的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，攻毒12 h后，试验期为7 d。试验期间观察小鼠发病情况，并进行细菌分离鉴定。

1.8 药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2019年推荐的标准K-B纸片法进行药敏试验和结果判断。

2 结果与分析

2.1 分离培养鉴定

疑似肺炎克雷伯菌在普通营养基上长出圆形、扁平、半透明的菌落；在鉴别培养基MIAC上长出了边缘整齐、大小一致、半透明的桃红色菌落(图1A)；通过革兰染色观察其形态，分离菌株在镜下呈阴性的2端钝圆粗短杆菌状(图1B)。分离株菌通过自动化微生物生化鉴定系统(Authoritative Typical Broad，ATB)鉴定为肺炎克雷伯菌，符合率在98%以上，其生化鉴定结果见表1。经统计，50株分离菌株被初步鉴定为肺炎克雷伯菌。

表1 水貂肺炎分离菌株的生化检测结果Tab.1 Biochemical test results of mink pneumonia isolates

2.2 细菌的PCR鉴定

用肺炎克雷伯菌khe基因引物对经培养特性、形态学及生化特性初步鉴定的50株肺炎克雷伯菌进行鉴定。结果显示，50株肺炎克雷伯菌分离株均扩增出约为489 bp的目的条带(图2)。测序结果显示，50株肺炎克雷伯菌分离株与GenBank中登录的15株肺炎克雷伯菌参考菌株的同源性均≥97.0%，证实分离的菌株为肺炎克雷伯菌。

2.3 致病性

试验组攻毒的昆明系小鼠在攻毒后2—5 d，出现精神沉郁、采食量减少、呼吸困难，个别小鼠出现急性死亡。剖检死亡的小鼠，可见其肺部出现出血、水肿；肝、脾出现不同程度的出血，且从死亡小鼠的肺部、肝脏中分离得到肺炎克雷伯菌。未攻毒组的小鼠健康存活。通过统计，有42株肺炎克雷伯菌可以引起小鼠发病，对小鼠具有致病性。

2.4 耐药性

用K-B药敏纸片法检测42株致病性肺炎克雷伯菌的耐药性，结果见表2。由表2可知，42株致病性肺炎克雷伯菌对临床中常用抗生素产生不同的耐药性，其中对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、强力霉素、磺胺二甲氧嘧啶7种药物耐药性较高，耐药率为59.5%—100.0%，对头孢噻呋、头孢曲松、头孢喹肟、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、林可霉素7种药物耐药率较低，耐药率为7.1%—40.5%。

表2 水貂肺炎分离菌株的耐药性Tab.2 Drug resistance of mink pneumonia isolates

3 讨论

肺炎克雷伯菌是临床中主要人畜共患病病源之一，该菌主要侵袭宿主的呼吸道、消化道和泌尿生殖道，当外界环境改变或者动物机体抵抗力低下时，该菌在体内大量繁殖并致病，发生内源性感染，其感染率和死亡率均较高[7-8]。相关研究表明，水貂感染肺炎克雷伯菌后，继发大肠杆菌、绿脓杆菌或巴氏杆菌等，呈现混合感染的状态，该菌在水貂体内的潜伏期是1—3 d，主要临床表现为呼吸困难，同时伴有咳嗽，急性感染可以造成鼻孔、嘴角出血[11]。肺炎克雷伯菌对水貂养殖危害较大，在河北、山东、辽宁、黑龙江等多个地区流行，给水貂养殖业造成严重的经济损失[12-14]。本研究从秦皇岛地区水貂养殖场采集的患出血性肺炎貂的肺脏、心血、肝脏等86份病料组织中，分离得到42株致病性肺炎克雷伯菌，说明该地区肺炎克雷伯菌流行较严重，应注意该病的防控。肺炎克雷伯菌通过呼吸道进入肺部，引起肺部实变和肺炎，进一步研究致病机理，对该病的防控具有重要的意义。

国内许多研究[15]表明，肺炎克雷伯菌对临床中常用的抗生素产生多种耐药性，从临床中分离的菌株对β-内酰胺类及碳青霉烯类抗生素也产生耐药性，给该病治疗带来了很大的困难。张文举[16]报道分离的狐源肺炎克雷伯菌对磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲氧嘧啶、替米考星和头孢拉丁耐药率最高。韩坤等[12]报道了山东、辽宁及黑龙江地区分离的20株貂源肺炎克雷伯菌分离株对常用抗生素产生多重耐药性。杨延等[8]研究表明，从黑龙江地区分离的狐源肺炎克雷伯菌对氨苄西林、青霉素钠、四环素等8种药物耐药性较高。本研究表明，42株致病菌对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、强力霉素、磺胺二甲氧嘧啶7种药物耐药性较高，耐药率为59.5%—100.0%，对其他药物的耐药率为7.1%—40.5%，说明该地区分离的貂源肺炎克雷伯菌耐药性严重。与上述的报道存在一定的差异性，这可能与感染宿主、地区及药物的使用有关。本研究表明，同一地区不同时间分离的肺炎克雷伯菌的耐药性也存在差异性，需要进一步研究其耐药机制。本研究结果可为水貂肺炎克雷伯菌的防控及合理用药提供参考依据。