黄桃果酒发酵工艺优化及香气成分分析

李明瑕，刘春凤，王 壬，郑飞云，王金晶，钮成拓，李 崎

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）

桃属于蔷薇科，李属，起源于我国的西北高原，后广泛分布于亚、非、欧、美、澳等5个大洲[1]。桃品种按照果肉的颜色可以分为白肉桃、红肉桃、黄肉桃[2]。其中黄肉桃因颜色鲜艳、香气浓郁，在国内外市场上有很强的竞争力。黄桃果肉含有大量的碳水化合物、有机酸、维生素、膳食纤维和饮食抗氧化剂，营养价值十分丰富[3]。然而，黄桃的可用性受到季节和货架期的限制[4]，严重影响了我国黄桃产业的发展。黄桃的深加工可以满足无桃季节市场的需求，现阶段我国黄桃的加工产品主要是黄桃罐头、桃汁、速冻桃片、黄桃酸奶等低值产品[5-6]。因此，为了避免黄桃上市时大量的资源浪费，有必要开展黄桃深加工技术，提升黄桃的附加值和市场竞争力。

果酒是以新鲜水果或果汁为原料，经酵母发酵酿制而成的一类低酒精度饮料[7]，是水果的主要加工途径之一。黄桃果酒是黄桃较理想的食用途径和深加工模式，它可以最大限度地保留黄桃中的营养成分，减少损失，还可以满足果酒市场多样化的需求。

目前国内外对黄桃的研究主要集中在生物活性物质的测定[3，8-9]和黄桃去皮工艺[10]等方面，只有少量关于发酵工艺的研究[11]，但都没有关注发酵参数对感官品质的影响。同时市面上仅有的几款黄桃酒类产品也都是配制酒，缺乏黄桃发酵酒类型产品。作者选用浓缩黄桃汁，通过对影响果酒发酵的主要参数进行单因素实验结合Box-Behnken响应面法获得黄桃果酒最优发酵工艺，随后对实验室制得的黄桃果酒与市售产品的抗氧化能力和风味物质进行了分析和比较，以期为黄桃果酒的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 酿酒酵母YP-01：作者所在实验室保藏。

1.1.2 试剂 黄桃浓缩汁参数：可溶性固形物44.5%，总酸（18.05±0.11） g/L；白砂糖，柠檬酸，碳酸钙：市售。

1.1.3 仪器 电热恒温培养箱BSP-250：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；精密数显PH计FE20：北京Hanna公司；超净工作台SW-CJ2D：苏州空气净化设备厂；高速冷冻离心机5804R：Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄桃果酒发酵流程 黄桃浓缩汁→调整成分（酸度、糖度）→灭菌（105 ℃、10 min）→接种→主发酵→离心→成品

1.2.2 黄桃果酒发酵条件优化

1）单因素实验 调整黄桃浓缩汁成分至糖质量浓度为120 g/L，可滴定酸5.68 g/L，分别以初始糖质量浓度 140、160、180、200、220 g/L，主发酵温度19、22、25、28、31 ℃，初始 pH 3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，酵母接种量 3×106、6×106、9 ×106、12 ×106、15×106CFU/mL，氮添加量 100、200、300、400、500 mg/L 进行黄桃果酒发酵单因素实验，当24 h失重小于0.1 g/dL时结束发酵，对黄桃果酒进行感官品评和乙醇体积分数检测。

2）产品类型 黄桃果酒发酵后平均含糖8.5 g/L，总酸8.5 g/L，口感偏酸，不符合大多数人的口味。调整发酵后果酒至糖质量浓度 13、18、23、28、33、38、43 g/L。对调整的黄桃果酒进行感官品评，以确定该黄桃果酒最适的产品类型。

3）Box-Behnken响应面优化黄桃果酒发酵条件在单因素实验的基础上[12-14]，选定主发酵温度、初始pH和接种量3个影响较大的因素，以感官评分为评价指标，进行三因素三水平的响应面优化实验，各因素及水平编码见表1。

表1 Box-Behnken实验因素及水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

1.2.3 黄桃果酒的评价

1)感官评分标准 感官评分标准按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]中介绍的方法进行，由11名具有感官品评经验的专业人员根据表2中的评分标准进行评价。在（22±1）℃的室温下，将黄桃酒样品装入品评杯中呈递给小组成员，对每个黄桃酒样的得分取11人平均值，即该酒的感官得分。

表2 感官评定表Table 2 Sensory evaluation

2）理化指标检测方法 乙醇、总酸、挥发酸、总糖和总SO2测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；总酚和DPPH清除率的测定参照杨冬梅等[16]的方法；维生素C测定参照郑京平等[17]的方法；羟自由基（OH-）清除率参照刘亚娜等[18]的方法。

3）挥发性化合物测定 通过SPME-GC-MS测定黄桃果酒中挥发性化合物，GC-MS条件参照李凯[19]等的方法。未知化合物的定性通过与NIST 05质谱库中标准谱图比对确定，化合物的定量通过在体积分数为10%的乙醇溶液中配制待测化合物标准溶液，根据定量化合物与内标化合物峰面积的比值与定量化合物的浓度绘制标准曲线，依据标准曲线确定果酒中挥发性化合物的质量浓度。

香气活力值[19]（OAV）用于评价香气物质对样品整体香气的贡献，OAV的计算值等于某种挥发性化合物的质量浓度与该物质阈值的比，通常认为OAV≥1的物质是果酒中主要呈味化合物。

1.2.4 数据处理 采用Design-Expert 10.0软件进行试验设计，采用origin 2018、SPSS软件进行作图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

初始糖质量浓度的高低直接影响发酵液的乙醇体积分数和风味物质质量浓度，进而影响黄桃果酒的品质。不同初始糖质量浓度对黄桃果酒乙醇体积分数及感官品质的影响见图1（a）。发酵后果酒的乙醇体积分数随初始糖质量浓度的增加而增加，当初始糖质量浓度为180 g/L时，发酵果酒乙醇体积分数为10.6%，酒体相对丰满，同时感官得分最高。但当初始糖质量浓度继续升高，乙醇体积分数升高的幅度逐渐减小，同时感官评分也在降低。

图1 不同发酵条件对黄桃果酒感官品质和乙醇体积分数的影响Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the sensory quality and alcohol content of yellow peach wine

不同发酵温度对黄桃果酒乙醇体积分数及感官品质的影响见图1（b）。发酵温度低于22℃时，发酵时间相对延长，发酵不彻底；而发酵温度高于28℃时，发酵速度较快，但感官得分相对降低。低温发酵能够增加果酒的花香和水果香气，但会抑制酵母的生长，降低糖的消耗速率；随着温度的升高，酵母生长速率提高，但高温会导致酵母自溶，存活细胞减少[20]。发酵温度为25℃时，酒体丰满，乙醇体积分数为 10.67%，感官评分最高，为78.9。因此，选择25℃为最适发酵温度。

不同初始pH对黄桃果酒乙醇体积分数及感官品质的影响见图1（c）。不同pH下发酵时间没有差别，说明pH 3.0～4.2的环境对酵母的发酵活性没有显著影响。当初始pH为3.0时，发酵后果酒酸味较为尖锐，感官评分略低；当初始pH较高时，发酵后果酒有明显的苦涩感。综合发酵速度、乙醇体积分数、感官评分，选择pH 3.3为最适初始pH。

不同酵母接种量对黄桃果酒乙醇体积分数及感官品质的影响见图1（d）。当酵母接种量低于6×106CFU/mL时，发酵时间相对延长，接种量达到15×106CFU/mL时，乙醇体积分数明显降低。酵母接种量较低时，代谢繁殖速度缓慢，污染杂菌的风险增加；酵母接种量过多时，菌群大量繁殖消耗营养成分，破坏发酵环境致使酵母提前衰老并发生自溶，影响果酒风味[21]。综合发酵时间、乙醇体积分数和感官品评结果，选择9×106CFU/mL为黄桃果酒发酵最适接种量。

不同的主发酵温度、初始糖质量浓度、pH、接种量对发酵时间均有影响，但总的来说，黄桃果酒发酵速度偏慢，氮含量成为酵母发酵限制因子。不同氮添加量对黄桃果酒乙醇体积分数及感官品质的影响见图1（e）所示。提高氮添加量后，发酵速率和感官得分明显提高。综合发酵速率和感官评分，发酵前氮的最适添加量为200 mg/L。

2.2 产品类型

根据每日失重监测发酵速度，当24 h失重小于0.1 g/dL时结束发酵，所得黄桃果酒平均糖质量浓度和总酸质量浓度均为8.5 g/L，口感偏酸，表明该浓缩黄桃汁发酵黄桃果酒不适合发酵成干型、半干型。不同类型的黄桃果酒感官评分见表3。

表3 不同产品类型感官得分Table 3 Sensory scores for different product types

根据感官评分结果，当发酵后总糖为23 g/L时，糖酸比为2.71，酸甜平衡程度最好。因此，该浓缩黄桃汁适合制成糖质量浓度为23 g/L的半甜型黄桃酒。

2.3 Box-Behnken响应面试验

在单因素实验的基础上，考虑发酵后乙醇体积分数为10.67%左右，糖质量浓度在23 g/L时感官评分最佳。国家标准GB 2758—2012《食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒》[22]中规定乙醇体积分数≥10%的发酵酒可免于标示保质期，说明乙醇体积分数在10%以上有利于果酒贮藏。氮添加量为200 mg/L时感官评分最高，再提高添加量感官评分降低，还会增加生产成本。为生产乙醇体积分数10.67%左右，糖质量浓度23 g/L的半甜型黄桃果酒，固定初始糖质量浓度为195 g/L，氮添加量200 mg/L。选择初始pH、接种量、主发酵温度3个因素为分析对象，发酵过程监测总糖变化，当糖质量浓度为23 g/L时结束发酵，以感官评分为响应值，利用Design Expert 10软件设计三因素三水平的响应面实验，实际方案和结果见表4。通过软件对数据进行了回归拟合，得到感官评分与初始pH（A）、接种量（B）、主发酵温度（C）的回归方程：

感官评分=87.50+2.23A+0.65B-0.94C-0.29AB-0.80AC-1.19BC-6.14A2-7.38B2-0.90C2

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Box-Behnken experiment design and results

利用软件对模型进行了方差分析和回归系数显著性检验，结果见表5。由表5可知，响应面优化后的模型P＜0.000 1，说明该模型可信。失拟项P＞0.05，说明该模型与试验结果拟合较好，能反映实际情况。由回归方程和方差分析可知，一次项A（pH）、C（温度）、二次项A2、B2和交互项BC对感官得分的影响达到极显著水平（P＜0.01），一次项B（接种量）、二次项C2、交互项AC对感官得分的影响达到显著水平（P＜0.05）。根据F值的大小，可知3个因素对黄桃果酒感官评分影响的程度是：初始pH＞主发酵温度＞接种量。

表5 回归模型方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

根据Design-Expert 10.0软件，获得了主发酵温度、初始pH、接种量交互作用对感官品质影响的三维响应面曲线，见图2。可以看出，温度和pH、温度和接种量等高线图呈明显的椭圆形，表明两因素交互作用较明显，与表5方差分析结果一致。通过回归模型的预测，得到黄桃果酒发酵最优工艺条件为：初始 pH 3.367、接种量 9.281×106CFU/mL、主发酵温度22.967℃，在该条件下黄桃酒感官评分预测值为88.101，实际操作时根据操作条件修正主发酵温度为23℃，初始pH 3.4，接种量9.3×106CFU/mL。

图2 发酵条件对感官评分交互影响的曲面图Fig.2 Surface plot of interactive effects of fermentation conditions on sensory scores

2.4 响应面验证实验及理化指标分析

在主发酵温度为23℃、初始pH 3.4，接种量9.3×106CFU/mL的工艺条件下进行3次黄桃果汁发酵验证实验，同时对制得的黄桃果酒和3款市售的黄桃酒产品的理化指标进行了比较，结果见表6。

表6 黄桃果酒的理化指标分析Table 6 Analysis of physical and chemical indexes of yellow peach wine

目前，国内市售黄桃酒绝大部分为配制酒。由表6可以看出，发酵型样品1糖质量浓度为22.41 g/L，属于半甜型酒，样品2～4的糖质量浓度均大于50 g/L，属于甜型酒；其中样品4中挥发酸是GB 15037—2006《葡萄酒》[23]中规定最高含量的3.9倍，挥发酸质量浓度过高会带来尖酸感和不快的醋味，这可能是其感官得分较低的重要原因。样品1感官评分为88.20分，与3.3中软件预测值相近；样品3在市售3种配制酒中得分最高为72.34，但其抗氧化物质总酚的质量浓度仅为样品1的17.8%，并且不含维生素C。相比之下，发酵型样品1中抗氧化物质总酚和维生素C质量浓度均较高，分别达351.07 mg/L和100.65 mg/L；同时，样品1的体外抗氧化力较高，DPPH和羟基自由基清除率分别为31.44%和98.84%。综上所述，优化工艺下制得的黄桃果酒的口感和抗氧化能力均优于市售的3款配制型黄桃酒。

2.5 黄桃果酒香气成分分析

2.5.1 主要香气化合物定量分析 采用SPMEGC-MS对最优工艺条件下制得的黄桃果酒 （样品1）与3种市售黄桃酒（样品2～4）中主要挥发性化合物进行定量分析，结果见表7。其中醇类物质8种、酯类物质16种、脂肪酸类物质4种以及萜烯/内酯类物质4种。

表7 黄桃果酒挥发性化合物定量分析Table 7 Quantitative analysis of volatile compounds in yellow peach wine

续表7

挥发性化合物在酒类产品的质量中起重要作用，通过GC-MS分析了黄桃果酒中的挥发性化合物组成。在黄桃果酒的各类挥发性化合物中，醇类和酯类在数量上是果酒中最大的芳香族化合物。醇类物质是果酒醇甜和助香剂的重要来源[24]，样品1中醇类物质质量浓度最高为 （81.45±7.07）mg/L，样品3最低，仅为样品1的45%。黄桃果酒中质量浓度较高的醇类物质有异戊醇、异丁醇、正丙醇和苯乙醇，占定量的醇类化合物的99.32%～99.46%。酯类物质在果酒中呈现出花香和果香，样品4中酯类物质质量浓度最高为（135.07±5.01）mg/L，其中乙酸乙酯占总酯的62.9%。样品1酯类物质质量浓度最低，为（21.45±1.33） mg/L。 但从酯的种类来看，样品1中乙酸辛酯、乙酸己酯、2-糠酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯等9种酯类物质均高于其他3款产品，多种化合物的共同作用可能导致样品1有更高的风味复杂性。脂肪酸类化合物中含量较多的有正癸酸、己酸和辛酸，占定量的脂肪酸类化合物的97.49%～97.70%。萜烯/内酯类化合物也是重要风味物质[25]，含量相对较低，但在风味的构成中起到重要的作用。

2.5.2 香气活力值及主成分分析 挥发性化合物对果酒香气的贡献取决于化合物在果酒中的阈值，OAV＞1的成分是样品主体呈香化合物。定量的30种挥发性化合物中，有11种化合物的OAV值大于1，可能是黄桃果酒的主体香气成分，见表8。

表8 黄桃果酒香气活力值比较Table 8 Comparison of odor activity value of yellow peach wine

对OAV值大于1的11种化合物进行主成分分析能够区分这4种黄桃果酒，见图3。前两个主成分的贡献率为81.8%，表明前两个主成分解释了原香气特征变量81.8%的方差信息。与第一主成分呈现正相关的物质有异戊醇、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇和正癸酸，样品1主成分得分在PC1的正向，说明与市售果酒相比，样品1与异戊醇、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇和正癸酸有很强的相关性，推测由于多种香气化合物的共同作用导致样品1的香气更为协调，因此有更高的感官得分。样品4与乙酸乙酯和异戊酸乙酯有很强的相关性，其质量浓度分别是其他果酒的3.8倍和1.38倍，可能因此造成了果酒风味的失衡。样品2与乳酸乙酯和己酸有很强的相关性。样品3与丙位癸内酯相关性较高，挥发性化合物质量浓度都略低于其他3款产品，可能因此导致样品3风味不突出。

图3 主成分载荷和得分双重图Fig.3 Loading plot and score plot of principal components analysis

3 结语

通过单因素实验探究了初始糖质量浓度、主发酵温度、酵母接种量和氮添加量对黄桃果酒发酵的影响，在单因素实验基础上结合Box-Behnken响应面试验优化，得到糖质量浓度23 g/L的半甜型黄桃果酒发酵的最佳工艺条件为：初始糖质量浓度195 g/L，主发酵温度23℃，初始pH 3.4，接种量9.3×106CFU/mL，氮添加量200 mg/L。实验室制备黄桃果酒与市售产品相比，自制果酒的抗氧化物质质量浓度及抗氧化能力均优于市售产品。通过SPME-GC-MS定量分析和香气活力值确定了异戊醇、正丙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、正癸酸、己酸、辛酸和丙位癸内酯等11种化合物为黄桃果酒的主要风味化合物，主成分分析显示实验室制备果酒与多种醇和酯有很强的相关性，风味更加协调。该优化黄桃果酒发酵工艺为黄桃果酒的开发和品质调控提供了一定的借鉴作用。