湖北崇阳县应用Smal-007菌剂防治松材线虫病效果

徐红梅 殷涛 赵青 罗治建 王建敏 汪如珍 熊琰

摘 要： Smal-007菌株分离自美国松材线虫体表，具有较好森防潜能。2018～2019年连续两年在湖北省崇阳县项目示范区大面积喷洒Smal-007菌剂防治松材线虫，项目实施期间取得了较好的防治效果。

关键词： 松材线虫病;生防细菌;防效

中图分类号：S763.712   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2021）05-0024-04

Control Effect of Pine Wilt Disease Using A Biological Control Agent of Smal-007 in Chongyang，Hubei Province

Xu Hongmei（1） Yin Tao（2） Zhao Qing（2） Luo Zhijian（2） Wang Jianmin（3） Wang Ruzhen（3） Xiong Yan（2）

（ 1.Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075;

2.Hubei Forest Pest Control and Quarantine General Station Wuhan 430079;

3.Chongyang County Forest Pest Control Station Xianning 437521）

Abstract： The strain Smal-007 of Stenotrophomonas maltophilias was isolated From America as a biocontrol agent for controlling pine wilt disease.A large-scale experiment was performed in forest in Chongyang，Hubei Province.The spraying was performed for once a year，in 2018 and 2019，respectively.The number of wilting and dead pine tree was significantly reduced in experiment district.

Key words： Pine wilt disease;biocontrol bacteria;control effect

松材線虫病，又称为松材线虫萎蔫病，被公认为松树的“癌症”。松材线虫病主要分布于美国、加拿大、墨西哥、日本、中国、韩国、朝鲜、法国、尼日利亚和葡萄牙等多个国家[1]。中国自1982年首次发现松材线虫病以来，该病已迅速蔓延至天津、辽宁、江苏、安徽、广东、浙江、湖北等18个行政区，造成巨大的经济损失，严重威胁我国森林安全[2]。

美国是松材线虫病原产地，但很少有松树大面积枯死。从病原、传播媒介、寄主和环境等几个影响松材线虫病流行的重要因素对比分析，很多学者认为主要原因在于美国松材线虫致病力较弱，而研究表明这与其线虫体表附着的细菌有密切关系[3]。

南京林业大学从美国松材线虫体表分离筛选到一株嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomnas maltophilia Smal-007具有较好生防潜能：该菌致病力弱，定殖和替代能力强，对环境安全无毒[3-6]。目前，应用该菌在安徽安庆、怀宁、当涂、福建三明市开展林间防治松材线虫试验，防治效果较好[7-9]。

近年来湖北省松材线虫病呈现快速扩展蔓延态势，防治松材线虫病的形势十分严峻。湖北省林业局将“松材线虫病新型生防菌剂推广示范”列为2017年度中央财政林业科技推广示范项目。该项目于2018～2019年连续两年在湖北省崇阳县项目示范区喷洒Smal-007菌剂防治松材线虫，总结如下。

1 材料与方法

1.1 示范区概况

本项目试验示范区位于湖北省崇阳县白霓镇和桂花泉镇。崇阳县地处湖北省南陲，居湘、鄂、赣三省交界处，位于北纬29°12～29°41，东经113°43～114°21之间。亚热带季风气候，日照充足，温和多雨，无霜期长，年平均气温17.0 ℃，年均降雨量1 312 mm，试验示范区林分类型为针阔混交林，不同的小班树种组成（阔叶树种类、针阔比）有所不同。总体说来，白霓镇试验示范林以马尾松Pinus massoniana为主，混有少量南酸枣Choerospondias axillaris、枫香树Liquidambar formosana、苦槠Castanopsis sclerophylla等阔叶树种，桂花泉镇试验示范林包含阔叶树种比例稍高，阔叶树种主要有苦槠、南酸枣、柃木Eurya japonica、檫木Sassafras tzumu等。

1.2 样地设置

2017年底完成样地设置和防治前调查工作。样地设置采用典型取样法，即在白霓镇、桂花泉镇试验示范区内按照不同的地形、坡度及林分状况，有选择性地设置样地3个，大小为0.67 hm2。同时在附近未防治区，设置相同面积对照样地1个，总共设置样地8个。记录每个样地地貌（中山、丘陵、平原）、坡度、坡向、坡位、林分种类及经营等级（好、中、差）等基本情况。

每个样地周围设置固定标识，样地内每株马尾松编上编号并用红色油漆标识。每年5～10月，在每个样地内挂设APF-I诱捕器1个诱捕松墨天牛，用于定期监测试验示范区松墨天牛数量变化及携带Smal-007生防菌情况。

1.3 供试菌株和菌剂制备

Smal-007菌株：从美国松材线虫体表分离，经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌，由南京林业大学森林病理实验室提供。

将保存于NA平板上的Smal-007菌株划线活化，挑取单菌落接种于NB培养基中，于28 ℃、180 r/min于恒温摇床上震荡培养36 h，作为种子液，将种子液倒入装有发酵培养基的发酵罐中发酵。发酵培养基和发酵主要参数参照刘侃诚方法进行[7]。发酵好的Smal-007菌剂，装入灭菌的25 kg塑料桶中保存运输。

1.4 喷施发酵液

2018～2019年5月喷施前密切留意天气预报，选择无雨的天气进行喷洒菌剂，尽量保证喷洒后48 h内无降雨。2018年5月16日，在崇阳县项目示范区采用欧直小松鼠AS350B3直升机吊挂美国Laolaer3900-350B2农林喷洒作业设备共飞行3个架次，每次装药800 kg，采取低容量喷雾，喷洒量为4.50～5.25 kg·hm-2，林间喷洒要求均匀全面，不留死角。2019年5月27日采用罗宾逊R44直升级吊挂美国农林喷洒作业设备飞行13个架次，每次装药200 kg，喷洒方式和喷洒量与2018年相同。各试验林分别选取立地条件和发病条件基本相同的林地作为对照区。每年8～10月，对试验示范区松材线虫病枯死树进行调查统计，结合对照区病死树情况，评价Smal-007林间防治效果。

防治效果计算方法如下：

枯死株降低率（%）=（防治前平均每公顷枯死株数-防治后平均每公顷枯死株数）/防治前平均每公顷枯死株数×100%;

防治效果（%）=[（100-对照区枯死降低率）-（100-防治区枯死降低率）]/（100-对照区枯死降低率）×100%。

1.5 生防菌林间定植检测

喷洒Smal-007菌剂后当年和第2年6～8月，在林间悬挂APF-I型引诱器诱捕松墨天牛，以选择性培养基富集法，并结合DNA测序技术，检测其携带的细菌来评估生防菌林间定殖情况。

制备选择性培养基，将活天牛放入液体培养基中振荡培养36 h。吸取0.5 mL培养液于选择性培养基平板中央，用细菌涂布均匀涂抹在平板表面。将平板倒置于28 ℃恒温培养箱，待菌落长出后，根据菌落形态、大小进行分类并统计各菌落比率。随机挑取5个疑似Smal-007菌株，在NA平板上划线纯化，30 ℃恒温倒置培养，待菌落长出后，送至生物技术有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库比对，完成細菌16SrDNA测序验证。根据选择性培养和测序结果，计算各采集点天牛携带Smal-007菌株比率。以没有喷洒菌剂林分诱捕到的松墨天牛作为对照。

2 结果与分析

2.1 菌剂林间防治效果

2018年5月喷洒菌剂时，当日天气条件比较好，喷洒后36 h有降雨，雨量中等。2019年5月喷洒后48 h有降雨，雨量较大。分别于2017年、2018年和2019年10月底对试验地防治区和对照区进行松材线虫病枯死树调查，结果见表1。

2019年试验区所处鄂东南地区遭遇五十年一遇极端干旱天气，崇阳县自7月14日以后，高温少雨天气持续几个月，旱情十分严重，导致大量林木树势衰退甚至死亡。经调查，2019年项目示范区内有部分松树因干旱枯死。对因干旱枯死与松材线虫致死松树进行了区分，统计防治效果时将前者剔除。

根据表1结果计算枯死株降低率和防治效果。由表2可知，飞机喷洒Smal-007菌剂的白霓镇试验地，松树枯死株数明显减少，2018年较防治前（2017年）松树枯死株降低率为86.67%，2019年较防治前（2017年）年松树枯死株降低率为92.2%。对照区松树枯死株率没有降低。防治区与对照区相比，2018年防治效果为86.67%，2019年防治效果92.2%。飞机喷洒Smal-007菌剂的桂花泉镇试验林，松树枯死株数也显著减少，2018年较防治前（2017年）松树枯死株降低率为48.89%，2019年较防治前（2017年）松树枯死株降低率为91.1%。对照区松树枯死株降低率2018年和2019年均为11.11%。防治区与对照区相比，2018年防治效果为42.07%，2019年防治效果为90.1%。

2.2 生防菌林间定殖检测结果

2018年和2019年6～8月，在试验林诱捕松墨天牛，检测携带生防菌的松墨天牛数量，在此基础上评估生防菌在林间的定植情况，结果见表3。

喷洒Smal-007菌剂当年，总计诱捕到37头活松墨天牛，其中9头携带生防菌，携带生防菌天牛比例为24.3%;连续喷洒菌剂2年后，总计诱捕到41头活松墨天牛，其中19头携带生防菌，携带生防菌天牛比例为46.3%。未喷洒Smal-007菌剂的对照区诱捕到的天牛不携带生防菌。到由此看来，林间连续喷洒Smal-007菌剂两年后，松墨天牛携带生防菌的比例逐步增加，表明该菌剂逐步在林间定殖和繁衍。

本项目监测到携带Smal-007生防菌剂天牛比例比姚伍等人在福建三明市应用Smal-007生防菌防治松材线虫时监测数据偏低，除了不同地区的林分、气候等因素影响Smal-007生防菌定殖效果等原因，另一个重要影响因素为二者所使用的检测方法不同：姚伍等人采用的用酶联免疫仪抗体标记法更加灵敏高效，而本项目采用的16SrDNA测序法相对更加耗时，工作量大，效率偏低。

3 结论与讨论

研究人员推测，Smal-007生防菌通过替代松材线虫体表的产毒细菌，以使松材线虫丧失致病性，从而实现防治作用。Smal-007菌剂喷洒到林间后，可在松树的针叶、树皮甚至杂草表面定殖和繁衍。松墨天牛成虫在林间黏附生防菌。Smal-007极易在松墨天牛携带的松材线虫体表繁殖，迅速替代其体表致病细菌，从而导致被生防菌定殖的松材线虫丧失致病能力。另外，由于携带生防菌的线虫产生毒素能力较低，不能致死松树细胞，线虫也不易在树体内扩大繁殖，伤口会慢慢愈合。

根据其作用原理，Smal-007生防菌防治效果受到以下因素制约：一是生防菌不能主动侵入树体杀死线虫，对已经感染线虫并发病的松树没有治愈能力;二是Smal-007菌剂喷洒到林间后，需要一定的时间生长繁殖，难以在短期内被大量松墨天牛携带。显著防效不仅要求连续2年喷洒菌剂，还要求一定的防治面积以达到规模效应。另外Smal-007生防菌林间定殖和繁衍容易受到气候因素影响，尤其是喷菌后48 h内降雨会对细菌初步定殖产生影响，从而影响防治效果。

2018年白霓镇示范区松树枯死株数明显减少，2018年较防治前（2017年）松树枯死株率降低86.67%，防治效果为86.67%。2018年桂花泉镇试验地，松树枯死株数也明显减少，2018年较防治前（2017年）松树枯死株率降低48.89%，防治效果为42.07%。2018年桂花泉镇防治效果稍低，主要影响因素有：一是桂花泉镇示范区面积较小，只有91.13 hm2，未完全体现出规模效应;二是桂花泉镇示范林松材线虫病防治前已经发病严重，已经感染松材线虫并发病的马尾松数量偏多。

2019年白霓镇示范区较防治前（2017年）年松树枯死株率降低92.2%，防治效果为92.2%。2019年桂花泉镇试验地，松树枯死株数显著减少，2019年较防治前（2017年）松树枯死株率降低91.1%，防治效果为90.1%。

总体说来，本项目在崇阳县白霓镇和桂花泉镇应用Smal-007生防菌防治松材线虫，取得了较好的防治效果。

参 考 文 献

[1]杨宝君，潘宏阳，汤坚，等.松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus）[M].北京：中国林业出版社，2003：1-9.

[2]国家林业和草原局.2019年全国松材线虫病疫区公告（国家林业和草原局公告2019年第4号）[EB/OL].（2019-01-24）[2020-08-02]http：//www.forestry.gov.cn.

[3]曾腓力，贲爱玲，郑敬荣，等.美国松材线虫体表携带优势细菌的鉴定及致病性[J].浙江农林大学学报，2012（5）：696-702.

[4]乔雪娟.美国松材线虫体表优势菌株定殖及生存能力研究[D]南京：南京林业大学，2013.

[5]韩正敏，贲爱玲，曾腓力，等.利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法：CN102630534A[P].2012-08-15.

[6]韓正敏，曾腓力，贲爱玲，等.用于防治松材线虫病的菌株Smal-007及其应用：CN103205385A[P].2013-07-17.

[7]刘侃诚.松材线虫病生防细菌的研究.[D]南京：南京林业大学，2013.

[8]孙京天.美国菌株Smal-007对松树萎蔫病生防作用的研究.[D]南京：南京林业大学，2014.

[9]姚伍，郑催云，陈红梅，等.福建三明市应用Smal-007菌剂防治松材线虫病的效果[J].林业科学，2018（1）：168-173.

（责任编辑：唐 岚）