豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤的测定方法研究

徐 慧，高 宏，郭芳芳

（江苏省理化测试中心，江苏南京210042）

近年来，食品安全问题受到了全球的关注。豆芽是利用豆类为原料制发的一种蔬菜制品，因其营养丰富、味道鲜美、价格低廉［1］，成为广大消费者喜爱的食品（食材）。豆芽的制发过程区别于农作物的栽培、种植过程，由种子培育出可食用的“芽菜”，而4-氯苯氧乙酸等作为植物生长调节剂，曾在豆芽生产中被广泛使用，抑制豆芽生根、提高豆芽产量，如市面上销售的“AB水”、“无根水”等［2］。长期食用非法添加此物的食品，对人体健康会造成一定危害［3］，其中，4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤是导致“毒豆芽”事件的主要成分［4］。因此快速灵敏的4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤检测方法很有必要。

目前，4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤的测定方法一般是样品用酸化乙腈提取，提取液经分散固相萃取净化、浓缩或直接进液相色谱-串联质谱分析［5-10］，上述方法存在基质干扰强、假阳性率高、回收率低、检测时间长等问题。本方法采用QuECh⁃ERS快速前处理技术和三重四级杆复合线性离子阱质谱（Qtrap）特有质谱IDA扫描技术，优化填料配比和色谱质谱条件，在保证良好的灵敏度和重现性的同时实现高选择性，并有效去除样品中的假阳性干扰，为豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤的快速高效准确测定提供了参考。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

SCIEX Qtrap4500液质联用仪（美国AB公司）：配有喷雾离子源（ESI源）；TGL-15B台式高速离心机（上海安亭）。

1.2 试验药材与试剂

豆芽购于南京某大型菜市场，粉碎后-20℃保存。

6-苄基腺嘌呤100 mg（98.5%），DR；4-氯苯氧乙酸100 mg（98.5%），北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈：色谱纯，德国默克有限公司；甲酸：色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；QuEChERS离心管：含300 mg无水硫酸镁、100 mg C18、100 mgPSA，博纳艾杰尔公司。

2 方法

2.1 标准溶液配制

标准储备液：精密称取6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸标准品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为1 mg/mL标准储备液，-20℃保存。

混合标准中间液A（10μg/mL）：分别精密量取6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸标准储备液（1 mg/mL）各1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为10μg/mL的混合标准中间液A。

混合标准中间液B（1μg/mL）：精密量取混合标准中间液A（10μg/mL）1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1μg/mL的混合标准中间液B。

基质混合标准工作溶液：分别精密量取混合标准中间液B（1μg/mL）2.5、5.0、10、20、40、100μL，用空白基质提取液定容至1.0 mL，作为基质混合标准工作溶液。浓度依次为2.5、5、10、20、40、100 ng/mL临用新制。

2.2 样品处理

准确称取10.0 g（精确至0.01 g）试样置于50 mL具塞离心管，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速匀浆2 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g无水乙酸钠，涡旋混合1 min，以10 000 r/min离心5min使乙腈和水相分层。精密量取上层乙腈溶液4 mL置于QuEChERS离心管中，涡旋混合2 min，以4 000 r/min离心5 min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱测定。

2.3 色谱条件

色谱柱：C18柱，100 mm×3.0 mm，粒径2.7μm。流动相：A为含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈。梯度洗脱：0～1 min：90%A-10%B；1～4 min：2%A-98%B；4～5.5 min：2%A-98%B；5.5～7 min：90%A-10%B。流速：0.3 mL/min。柱温：35℃。进样量：5μL。

2.4 质谱条件

4-氯苯氧乙酸离子对184.8>126.7、184.8>110.7，DP 40 V，CE22 V、22 V；6-苄基腺嘌呤离子对224.2>133、224.2>106、224.2>117，DP 80 V，CE31 V、46 V、47 V；均为负离子模式，离子源温度550℃；离子喷雾电压：4 500 V；气帘气：35 psi；雾化气和加热气55 psi。在多反应监测（MRM）的基础上建立自动关联扫描（IDA）并由MRM触发增强子离子扫描（EPI），指定触发最强的若干母离子执行EPI，执行动态背景扣除，IDA扫描范围设置50～260 Da，分段扫描段分别为50～71.518 Da、71.518～122.175 Da、122.175～217.908 Da、217.908～260 Da。

2.5 样品测定

按照上述色谱条件进样5μL，外标法定量。

3 结果与分析

3.1 仪器条件适用性

按照优化的色谱条件和质谱条件（2.3、2.4），在4min内实现4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤的良好分离，标准谱图见图1～3。

图1 4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤标准色谱图Fig.1 Chromatogram of 4-Chlorophenoxyaceticacid and 6-Benzylaminopurine

3.2 方法线性回归方程

以4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归方程，得出4-氯苯氧乙酸线性回归方程：

其相关系数0.998 2。

6-苄基腺嘌呤线性回归方程：

其相关系数0.997 9。线性相关系数均达到0.99以上，线性良好。

图2 6-苄基腺嘌呤质谱图Fig.2 Mass spectrogramof 6-Benzylaminopurine

图3 4-氯苯氧乙酸质谱图Fig.3 Mass spectrogram of 4-Chlorophenoxyaceticacid

3.3 加标回收率和重复性试验

称取10.0 g空白豆芽基质样品，分别作10、20、50μg/kg三个水平的加标，每个水平做三个平行，按1.3试验方法进行测定，计算回收率和相对标准偏差（RSD），以验证方法重复性，结果如表1所示：

表1 4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤回收率和RSDTable 1 4-chlorophenoxyaceticacid and 6-benzylaminopurine Recovery and RSD

结果表明，在10、20、50μg/kg三个水平的加标下，回收率为85.1%～92.1%，回收良好，每个水平下三个平行的RSD为0.35%～1.18%，方法重复性良好。

3.4 方法定量限

以基质空白所产生的仪器背景信号的10倍值的相应量定义为定量限。结果显示4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤定量限均为10μg/kg。图谱如下所示（图4）。

图4 阳性样品色谱图Fig.4 Chromatogram of positive sample

3.5 假阳性筛查判断

一般进行二级质谱时容易有假阳性出现，如图7-8所示，6-苄基腺嘌呤有检出，色谱图出峰时间和二级质谱匹配，于是在MRM基础上建立IDA并由MRM触发EPI扫描，执行动态背景扣除，排除假阳性，通过三级谱图比对，结果显示确实是假阳性，如图9所示。

图5 背景噪音图Fig.5 The noise spectrogram of background.

图7 假阳性6-苄基腺嘌呤色谱图Fig.7 Chromatogramof false positive 6-benzyl adenine.

图9 6-苄基腺嘌呤标准三级谱图Fig.9 Spectrumtertiary of standard 6-benzyl adenine.

4 讨论与结论

本文建立了液相色谱-串联质谱法可快速准确测定豆芽中两种生长调节剂4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤。样品经过酸性乙腈提取后，采用QuECh⁃ERS快速前处理技术进行净化，所采用的QuECh⁃ERS离心管与传统的方法［9］相比增加了100 mg PSA，PSA填料比氨基柱具有更强的离子交换能力，同时具备阴离子交换作用与极性相互作用，广泛用于植物农残分析样品的处理，有效降低了样品基质的干扰，大大提高方法灵敏度。利用Qtrap质谱特有MRM-IDA-EPI扫描模式，对低丰度目标物进行鉴定和定量分析，从而有效降低假阳性的发生、提高方法的准确度；同时用Qtrap质谱特有的抗基质干扰，实验前处理过程无需浓缩，缩短样品前处理时间和上机时间。

图6 定量限图谱Fig.6 The spectrogram of limit of quantification.

图8 假阳性6-苄基腺嘌呤三级谱图Fig.8 Spectrumtertiary of false positive 6-benzyl adenine.

所建立的液相色谱-串联质谱法操作简单，灵敏度高，能快速、准确检测出豆芽中的4-氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤，线性良好，相关系数均大于0.99，定量限均为10μg/kg，加标添加量10～50μg/kg时，回收率为85.1%～92.1%，RSD为0.35%～1.18%。