温度胁迫对湖北钉螺部分呼吸酶的影响

潘中武，桂琳，胡霞，章琴，周书林

1.皖南医学院医学微生物与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002；2.安徽中医药高等专科学校解剖学教研室；3.皖南医学院医学寄生虫学教研室

湖北钉螺(Oncomelaniahupensis)简称钉螺，为两栖淡水生物，是日本血吸虫的唯一中间宿主。钉螺分布范围广，孳生环境复杂，其分布与温度等环境因素相关，温度可以影响钉螺体内多种酶的活性[1]。既往研究表明，钉螺体内存在细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)[2]。COX为线粒体标志性酶，是生物氧化呼吸链中的末端酶，线粒体借助该酶将电子传递给氧，进而获得能量，为细胞代谢提供必要的ATP来源；SDH是动物有氧氧化过程中三羧酸循环的关键酶，是线粒体能量代谢、糖的有氧氧化的重要标志酶，其活性与生殖细胞的发生及发育等生命活动相关。既往研究发现，多种化学物质(如灭螺药)均可影响钉螺体内COX和SDH等多种酶活力[3-4]；在实验室条件下模拟春季外界气候变化，钉螺体内COX和SDH等酶活力也发生相应的变化[5]。

本研究在实验环境中，观察湖北钉螺在高温和低温胁迫作用下，钉螺软体组织中COX和SDH含量变化情况，以期丰富温度对钉螺影响的研究，为进一步控制钉螺提供参考。

1 材料与方法

1.1钉螺来源 于2019年3—5月采集湖北钉螺，采集地点为安徽省芜湖市湾沚区青弋江支流赵家河段有螺江滩，经逸蚴法判定为阴性钉螺，选取有7～8个螺旋、活力较强的成螺在实验室用去离子水驯养两周后备用。

1.2主要仪器和试剂 手持均质器(SFJ-10)购自力辰科技股份有限公司，多功能酶标仪(Infinite 200pro)购自帝肯贸易有限公司。细胞色素氧化酶(COX)和琥珀酸脱氢酶(SDH)ELISA检测试剂盒均购自贝克曼库尔特公司，4 ℃保存。

1.3钉螺分组及处理 将实验室驯养的钉螺随机分成3组，分别为低温胁迫组(下称低温组)、对照组、高温胁迫组(下称高温组)，每组40只，每组均设3个平行组。将钉螺放置在培养皿内，所有培养皿均先放置一层海绵，上面再覆盖一层粗草纸，在实验过程中培养皿中均始终保持一定的湿度(培养皿中积水不超过草纸面)。高温组和低温组分别放在37 ℃和4 ℃摇床中，对照组直接放在20 ℃的实验准备室内，24 h后将钉螺放置在-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.4COX和SDH含量的测定 将钉螺从-80 ℃冰箱中取出后立即解冻，用镊钳十字交叉法[6]碾压钉螺后，在体视显微镜下剔除螺壳，取出软体组织置于EP管中备用。取0.10 g软体组织，加入1 mL生理盐水，冰上匀浆，3 000 r/min离心30 min(离心半径为7.25 cm)取上清液备用。按ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，计算标准曲线方程，再将样品测出的OD值代入方程，分别计算钉螺COX和SDH含量(按说明书步骤操作，样品已被稀释5倍，故最终结果乘以5才是样本的实际浓度)。

2 结 果

2.1钉螺COX含量 COX标准曲线方程为y=0.222 2+0.013 6x-0.000 02x2，R2=0.995 0。对照组钉螺COX含量为(27.11±2.31)U/L，低温组和高温组分别为(21.90±0.32)U/L和(21.42±1.84)U/L，三组间不全相同，且差异有统计学意义(F=10.145，P<0.05)。与对照组相比，低温组和高温组钉螺COX含量均下降，且差异都具有统计学意义(P均<0.05)。

2.2钉螺SDH含量 SDH标准曲线方程为y=0.008 5+0.157 1x-0.002 6x2，R2=0.998 3。对照组钉螺SDH含量为(1.30±0.002)U/L，低温组和高温组分别为(1.24±0.05)U/L和(1.12±0.02)U/L，三组间不全相同，且差异有统计学意义(F=124.624，P<0.05)。与对照组相比，低温组和高温组钉螺SDH含量均下降，其中高温组下降更为明显，三组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨 论

胁迫原本用于逆境生理学的研究中，是生物所处的不利环境的总称。不同学者对胁迫均有不同的理解，其基本内涵是指对生物生存与发育不利的各种外界环境因子(包括生物因素与非生物因素)的总和[7]。环境因子中温度是一种可以对动物产生重要影响的生态因子，在适当的范围内，动物可以进行正常的生理活动，而超出这个范围就会引起生理活动异常，超出的范围过大就会导致动物死亡[8]。温度或温度与其他环境因子共同作用可以影响动物的生长、发育、繁殖及代谢等生理活动[9]。

线粒体是产生ATP以及细胞呼吸的部位，与呼吸相关的酶主要有COX、SDH、NADH 等[10]。COX是线粒体呼吸链中电子传递过程的终末复合物，是线粒体进行氧化磷酸化的关键酶，也是线粒体标志酶[11]，COX在钉螺体内分布广泛[1]。SDH属于膜结合酶，存在于所有的有氧呼吸细胞中，能与线粒体膜牢固结合，属于脱氢酶中最重要的酶[11]，SDH广泛存在于钉螺软体组织中[1]。因此COX和SDH的活性可在一定程度上反映有氧代谢的水平。研究温度胁迫状态下钉螺软体组织中COX和SDH活性的变化，对于揭示钉螺所需能量与温度之间的关系以及代谢水平均有重要的意义。

戴超[12]研究了温度对三疣梭子蟹呼吸代谢酶的影响，陆君[13]等研究了低温对拟穴青蟹抗氧化酶活性的影响，连春盎[14]研究了干露胁迫对脊尾白虾呼吸代谢相关酶COX的影响，以上研究均发现外界温度的改变对动物体内各种呼吸代谢酶会产生一定程度的影响。钉螺的最适宜生存温度为20～26 ℃，本研究发现在非适宜温度条件下，钉螺体内两种呼吸酶含量均有改变。低温或者高温胁迫状态下钉螺体内琥珀酸脱氢酶含量下降，这与赵伟民、宋志明等[15-16]研究的温度对白条锦蛇和点篮子鱼幼鱼SDH活性影响结果一致。低温或高温胁迫状态下钉螺体内细胞色素氧化酶含量同样也下降，这一结果与路允良[17]研究的温度对三疣梭子蟹代谢酶COX的影响结果一致。

变温动物最重要的生物学特征之一是其体温随着环境温度的改变而发生相应的变化，而动物的体温又直接影响着动物体内酶的活性并最终决定其新陈代谢的水平，影响各种组织器官执行相应的生物学功能[18]。当环境温度在适当的范围内发生改变时，变温动物通过体内生化体系的多种重构途径以消除或部分消除温度变化对机体造成的影响，从而维持生物体正常的新陈代谢活动。但当环境温度变化的幅度超过一定的范围，如冬季或夏季，部分变温动物会逐渐适应这种温度变化，不断降低新陈代谢水平直至进入休眠状态(冬眠或夏蛰)。本研究结果表明，在温度胁迫状态下钉螺两种呼吸酶的活性均表现为下降，可能是通过抑制线粒体代谢，使有氧呼吸提供的能量减少，从而降低物质和能量消耗来对抗温度胁迫，但钉螺对温度胁迫的耐受程度及具体机制尚需进一步探索。