一种改善广西百色地区烟叶品质的混合微生物发酵技术

龙章德，苏赞，李季刚，薛云，刘启斌，宁振兴，毛多斌，魏涛

1.广西中烟工业有限责任公司 技术中心，广西 南宁 530001；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

广西百色地区具有土壤矿质营养含量高、日照充足、全年无霜期等烟草种植优势，是广西烟草最适宜的种植区之一，近年来也成为广西最大的烤烟种植区，但是广西百色B3F烟叶因香气量不足、杂气重、感官品质差等特点限制了其在卷烟配方中的应用.

目前，利用微生物处理低等次烟叶以提高其感官品质，已成为改善烟叶品质的一种重要方式. 如C.F.English等[1]从烟叶表面分离得到芽孢杆菌属的嗜热芽孢杆菌属，纯培养或混合培养后接种烟叶，抽吸时可以产生令人愉悦的香气；黄晓春[2]分离得到降碱增香的菌株，研究表明，经过菌剂处理的烟叶，其香气质和香气量都得到提升，烟碱含量降低，烟叶品质得到改善，可用性得以提高；赵铭钦[3]在烟叶表面筛选出巨大芽孢杆菌BCK，对其进行诱变处理得到对淀粉和蛋白质降解活性较高的菌株B8，利用该菌株发酵烟叶后，苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、茄酮、β-大马酮、巨豆三烯酮的3种异构体、西柏三烯-4-醇等的含量增加明显；庹有朋等[4]在发酵了1～2 a的烟叶上筛选出22株优势菌株，经7个月烟叶发酵，达到了现有技术发酵3 a的效果，增香提质作用明显.

近年来，研究人员还发现，利用混合菌种发酵烟叶的品质明显强于单一菌种发酵. 混合微生物处理技术能有效降解烟叶中淀粉、蛋白质、木质素、果胶等大分子物质，从而明显改善烟叶品质[5-8]. J.C.Dai等[9]从烤烟烟叶上筛选到嗜热枯草芽孢杆菌ZIM3和工程菌株ZIM1，烟叶经发酵后，淀粉和纤维素的生物降解效率提高了30%～48%，整体感官品质得到提升；巩效伟等[10]分别用产香微生物CXJ-3枯草芽孢杆菌、CXJ-7西姆芽孢杆菌和CXJ-12短小芽孢杆菌及其复合菌剂处理梗丝，发现，处理后梗丝的总糖、还原糖和挥发性香气成分含量均显著提升，其中以复合菌剂处理效果最好. 帅瑶[11]使用解淀粉芽孢杆菌GUHP86与GZU03复配菌种对大理红大CL314烟叶进行发酵，发现芳樟醇、β-大马酮、β-紫罗兰酮等香味物质的相对含量增加，且复合菌发酵比单菌发酵和自然发酵对烟叶品质提升作用更明显.

本实验室前期已经建立成熟的酿酒酵母发酵烟叶技术，并分离得到一株嗜麦芽寡养单胞菌，该菌可以将烟叶中2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇类物质转化为香味物质，进而有效改善烟叶品质[12-14]. 在前期实验中，采用酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌分别发酵广西百色B3F烟叶，烟叶品质虽有一定改善但是效果并不明显. 鉴于此，本文拟利用酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌对广西百色B3F烟叶进行混合微生物发酵处理，确定嗜麦芽寡养单胞菌的最佳发酵条件；分析混合微生物发酵前后烟叶常规化学成分、致香成分的变化，并研究发酵后烟叶感官评吸品质的提升效果，以期提高百色B3F烟叶的利用率.

1 材料与方法

1.1 材料

烟叶：广西百色B3F烟叶(广西中烟工业有限责任公司技术中心提供)，将烟叶粉碎后过40 mm的分样筛，制成实验样品备用.

菌株：酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeULI3[12]，嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供，其保藏编号为CGMCC No：13905).[13]

1.2 主要仪器与设备

主要仪器设备：SW-CJ-IF型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司产；LDZX-50KBS型立体压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产；同时蒸馏萃取装置，郑州科技玻璃仪器厂产；DLSB-1020低温冷却循环泵，郑州国瑞仪器有限公司产；DHP-9162恒温培养箱，太仓市科教器材厂产；7890C GC-MS色谱联用仪，美国Agilent公司产.

1.3 培养基配制

酿酒酵母培养基(M1)[12,14]：K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO33 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖30 g/L.

嗜麦芽寡养单胞菌培养基(M2)[13]：KNO31.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，麦芽糖 1 g/L.

1.4 实验方法

1.4.1 菌株培养从-80 ℃冰箱中取出酿酒酵母，转接固体培养基(M1培养基，另加入20 g/L琼脂)，在28 ℃培养箱里培养24 h. 挑选较大的菌落，接入30 mL的M1液体培养基中，在28 ℃、180 r/min条件下培养24 h，获得种子液. 以体积分数为2%的接种量接种于300 mL M1液体培养基中，在相同条件下培养24 h. 将菌液以8000 r/min的转速离心10 min，去除上清液，将沉淀溶于30 mL无菌水中，重复两次，备用.

从-80 ℃冰箱中取出嗜麦芽寡养单胞菌，转接M2固体培养基，在30 ℃培养箱里培养12 h. 挑选较大的菌落，接入30 mL的M2液体培养基中，在30 ℃、180 r/min条件下培养12 h，获得种子液. 以体积分数为2%的接种量接种于300 mL M2液体培养基中，在相同条件下培养12～16 h. 将菌液以8000 r/min的转速离心10 min，弃上清液，将沉淀溶于30 mL无菌水中，重复两次，备用.

1.4.2 酿酒酵母发酵预处理根据文献[14]的方法对广西百色B3F烟叶进行发酵预处理：取10 mL酿酒酵母菌悬液，均匀喷洒在50 g广西百色B3F烟叶上，在温度30 ℃，湿度70%的恒温恒湿箱中用密封袋密封培养48 h.

1.4.3 嗜麦芽寡养单胞菌发酵条件单因素试验设计使用嗜麦芽寡养单胞菌将经酿酒酵母发酵预处理后的广西百色B3F烟叶进行进一步发酵. 由于烟叶石油醚提取物包括挥发油、树脂、油脂、脂肪酸、蜡质、类脂物和色素，常常被作为衡量烟叶品质和香气的重要指标. 因此，本文以50 g预处理广西百色B3F烟叶为研究对象，以石油醚提取物质量分数为指标，优化嗜麦芽寡养单胞菌的发酵条件[15].

1)接种量：分别取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL嗜麦芽寡养单胞菌悬液均匀喷洒在预处理烟叶上，补充水分至湿度为70%，在28 ℃条件下发酵24 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数.

2)发酵温度：取5 mL嗜麦芽寡养单胞菌悬液均匀喷洒在预处理广西百色B3F烟叶上，补充水分至湿度70%，分别在22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃和36 ℃条件下发酵24 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数.

3)发酵时间：取5 mL嗜麦芽寡养单胞菌悬液均匀喷洒在预处理广西百色B3F烟叶上，补充水分至湿度为70%，在28 ℃条件下分别发酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数.

4)发酵湿度：取5 mL嗜麦芽寡养单胞菌悬液均匀喷洒在预处理广西百色B3F烟叶上，补充水分至湿度分别为30%、40%、50%、60%和70%，在28 ℃条件下发酵24 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数.

1.4.4 正交试验设计以石油醚提取物质量分数为指标，选取发酵接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、和发酵湿度(D)进行四因素三水平正交试验，以确定嗜麦芽寡养单胞菌最佳发酵条件. 正交试验各因素水平见表1.

表1 正交试验各因素水平表Table 1 The Table of various factors levels of orthogonal test

1.4.5 烟叶品质提升效果分析用嗜麦芽寡养单胞菌悬液在最佳条件下对预处理广西百色B3F烟叶进行发酵；用等量的无菌水，均匀喷洒在预处理广西百色B3F烟叶上，在同样的温湿度下密封培养同样的时间，作为对照组；以未用菌株发酵的广西百色B3F烟叶为空白组. 对比分析发酵前后烟叶常规化学成分和致香成分的变化，研究发酵前后该烟叶感官评吸品质的提升水平，以确定发酵后烟叶总体品质的提升情况.

1)常规化学成分的测定.参照文献[16-19]中的方法测定烟叶中总植物碱、总氮、钾、氯的含量；参照文献[20]中的方法测定烟叶中总糖、还原糖和淀粉的含量.

2)烟叶致香成分的提取.称取30 g过40 mm分样筛的烟末，置于1000 mL圆底烧瓶中，再加入100 g的无水硫酸钠和400 mL纯净水，振荡摇匀后，放入同时蒸馏萃取装置一端的电热套加热，在装置的另一边水浴锅中连接一个装有100 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶，两边同时进行60 ℃水浴加热，从第一次的加热回流开始计时，2.5 h后得到含有100 mL二氯甲烷的萃取液. 对萃取液进行萃取分离，得到中性萃取液，在中性萃取液中加入一定量的无水硫酸钠进行冷藏干燥，静置过夜后将样品蒸馏浓缩至1 mL左右，用GC-MS进行定量分析.

GC测试条件：HP-5 MS毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度为240 ℃；载气为He(纯度为99.999%)，流速为1.0 mL/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0 μL. 升温程序:设置50 ℃(4 min)后以3 ℃/min的速度升温到70 ℃(5 min)，再以2 ℃/min的速度升温到100 ℃(17 min )，然后以2 ℃/min的速度升温到120 ℃(10 min)，最后以6 ℃/min的速度升温到280 ℃.

MS测试条件：传输线温度280 ℃；离子源温度280 ℃；四级杆温度150 ℃；电子倍增器电压2.28 kV；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70 eV；溶剂延迟10 min；全扫描检测，扫描质量范围(m/z)35～500 amu.

3)烟叶感官评吸方法.邀请13位专业评吸人员，每位评吸人员在上午的同一时间段分别对单料烟进行评吸，每次抽吸6支卷烟，对每种单料烟进行3次评吸. 要求所有的专业评吸人员在规定的时间内完成评吸，否则评吸结果作废. 打分时按照单料烟九分制相关标准[21]，从烟叶的香气质、香气量、浓度、刺激性、杂气、劲头、余味7项指标进行感官评吸.

1.5 数据处理

采用Excel 2016对实验数据进行统计分析，利用SPSS 17.0进行显著性差异分析.

2 结果与分析

2.1 嗜麦芽寡养单胞菌发酵条件单因素试验结果

2.1.1 接种量接种量对石油醚提取物质量分数的影响如图1所示. 由图1可知，石油醚提取物质量分数先随着嗜麦芽寡养单胞菌接种量的增加而升高，当接种量为6 mL时，石油醚提取物质量分数达到最大，之后随着接种量的增加呈降低趋势. 这可能是因为接种量过大，菌体生长期细胞数量过多，影响了烟叶表面原有微生物的种群和代谢，造成石油醚提取物质量分数的降低. 因此，选取嗜麦芽寡养单胞菌发酵适宜接种量为6 mL.

图1 接种量对石油醚提取物质量分数的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on mass fraction of petroleum ether extract

2.1.2 发酵温度发酵温度对石油醚提取物质量分数的影响如图2所示. 由图2可知，随着发酵温度的增加，石油醚提取物的质量分数先增加，当发酵温度为32 ℃时，石油醚提取物质量分数最大. 随着发酵温度的进一步增加，石油醚提取物质量分数开始降低，可能是温度过高抑制了嗜麦芽寡养单胞菌的生长和代谢. 因此，选取嗜麦芽寡养单胞菌适宜发酵温度为32 ℃.

图2 发酵温度对石油醚提取物质量分数的影响Fig.2 The influence of fermentation temperature on the mass fraction of petroleum ether extract

2.1.3 发酵时间发酵时间对石油醚提取物质量分数的影响如图3所示. 由图3可知，在前48 h内，随着发酵时间的延长，石油醚提取物的质量分数逐渐增大，当发酵时间为48 h时，其质量分数达到最大，之后随着时间的延长，石油醚提取物质量分数缓慢降低. 因此，选取嗜麦芽寡养单胞菌适宜发酵时间为48 h.

图3 发酵时间对石油醚提取物质量分数的影响Fig.3 The influence of fermentation time on the mass fraction of petroleum ether extract

2.1.4 发酵湿度发酵湿度对石油醚提取物质量分数的影响如图4所示. 由图4可知，随着湿度的增加，石油醚提取物的质量分数呈先 升高后降低的趋势.当发酵湿度为60%时，石油醚提取物的质量分数达到最大，这是由于发酵湿度较低时，不能达到酶的活性和满足嗜麦芽寡养单胞菌生长繁殖的条件，随着湿度的增加，逐渐达到微生物生长的最佳条件；但发酵湿度过高时，烟叶易结块，影响其散热，有可能产生霉变，影响嗜麦芽寡养单胞菌的生长和代谢. 因此，选取嗜麦芽寡养单胞菌适宜发酵湿度为60%.

图4 发酵湿度对石油醚提取物质量分数的影响Fig.4 The influence of fermentation humidity on the mass fraction of petroleum ether extract

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表2，正交试验结果方差分析见表3. 由极差结果可知，影响石油醚提取物质量分数的因素大小依次为RA>RB>RC>RD，即接种量>发酵温度>发酵时间>发酵湿度；由方差分析结果可知，接种量对石油醚提取物质量分数影响极显著，发酵温度、发酵时间和发酵湿度对其影响不显著，正交试验结果最优组合是A3B2C1D3. 因此，最佳发酵条件是接种量8 mL，发酵温度32 ℃，发酵时间36 h，发酵湿度70%. 在此发酵条件下，石油醚提取物质量分数为16.50%.

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Orthogonal test results of variance analysis

2.3 发酵前后烟叶常规化学成分分析

混合微生物发酵前后B3F烟叶常规化学成分质量浓度如表4所示. 由表4可知，在嗜麦芽寡养单胞菌的最佳发酵条件下，微生物不仅分解淀粉等生物大分子，使烟叶的总糖和还原糖质量浓度明显增加，还可降低该类大分子物质对吸食品质的影响；烟碱、钾、氯和总氮的变化不明显，糖碱比和钾氯比的升高有利于提高烟叶的燃烧性. 烟叶常规化学成分比例的变化使其内部趋于协调，整体更为和谐，改善了卷烟的吸味品质，从而提高了烟叶的感官品质.

表4 混合微生物发酵前后B3F烟叶常规化学成分质量浓度Table 4 Mass concentration of conventional chemical components in B3F tobacco leaves before and after mixed microbial fermentation

2.4 发酵前后烟叶致香成分分析

混合微生物发酵前后烟叶中致香成分对比分析如表5所示. 由表5可知，经酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌混合微生物发酵处理的广西B3F烟叶总致香成分质量浓度增加64.21 μg/mL，总体变化不明显，但巨豆三烯酮、大马酮、茄酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯这6种重要致香成分总量变化较大，质量浓度由2 455.68 μg/mL提高到2 619.01 μg/mL，增加了6.65%. 烟叶的化学组成中，羰基化合物(酮类)和类脂类物质对烟气香味具有重要影响.利用酵母菌固态发酵烟叶，可以有效增加烟叶中羰基化合物(酮类)和类脂类化学物质，进而改善烟叶的品质，已有相关文献报道.胡志忠等[22]利用产香酵母对贵州烟叶进行固态发酵，发现在最佳发酵条件下，烟叶新增多种重要致香物质,其中包括糠醇、金合欢醇、β-环柠檬醛等. 陈笃建[23]用产香酵母处理低等级烟叶，处理前后烟叶成分和烟气成分差异不大，但香味物质巨豆三烯酮、正十六酸、香叶基丙酮、香叶醇等相对百分含量发生变化，改善了烟叶吸食品质.这与本文的研究结果一致.

表5 混合微生物发酵前后烟叶中致香成分对比分析Table 5 Comparative analysis of aroma components in tobacco leaves before and after mixed microbial treatment μg/mL

2.5 感官评吸结果分析

混合微生物发酵前后B3F烟叶的感官评吸结果如表6所示. 由表6可知，与空白组和对照组相比，试验组的香气质和余味均有所增加，刺激性和杂气减轻，烟气更加醇和细腻，卷烟余味舒适度增加，感官品质提高；试验组评吸分数为44.0，相比对照组有1.0分的提高，表明混合微生物发酵改善了烟叶的吸味品质.

表6 混合微生物发酵前后B3F烟叶的感官评吸结果Table 6 Sensory evaluation results of B3F tobacco leaves before and after mixed microbial fermentation 分

3 结论

本文以广西百色B3F烟叶为研究对象，在酿酒酵母对广西百色地区B3F烟叶进行发酵预处理的基础上，采用嗜麦芽寡养单胞菌对该烟叶进一步发酵，通过单因素试验和正交试验确定最佳发酵条件，建立了混合微生物发酵广西百色地区B3F烟叶技术；对比分析了混合微生物发酵前后广西百色地区B3F烟叶常规化学成分和致香成分的变化，并研究发酵后该烟叶感官评吸品质的提升水平. 结果表明：嗜麦芽寡养单胞菌发酵最佳工艺条件，接种量为8 mL，发酵温度为34 ℃，发酵时间为60 h，湿度为70%，在该条件下石油醚提取物质量分数为16.50%；混合微生物发酵后烟叶常规化学成分中总糖和还原糖含量均有所增加，烟叶糖碱比由6.77提高到7.55，烟叶中巨豆三烯酮、大马酮、茄酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯6种重要致香成分质量浓度增加了6.65%，这在一定程度上有效改善了烟叶的吸味品质；发酵后烟叶香气质有所增加，刺激性和杂气减轻，烟叶内化学成分间更趋于协调，卷烟余味舒适度增加. 本文所建立的酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌混合微生物发酵技术，可有效提高广西百色B3F烟叶的品质，今后需进一步完善该混合微生物发酵的中试放大工艺条件，以加快其在不适用烟叶提质增香中的推广应用.