分散微固相萃取-高效液相色谱法测定荷丹片中生物碱类成分的含量

刘永静， 于虹敏， 张 华， 陈 强， 陈达炜

荷丹片是由荷叶(君药)、丹参和盐补骨脂(臣药)、山楂(佐药)、番泻叶(使药)等五味中药组成的复方制剂，是我国著名老中医杨济生先生独创的方剂。荷丹片具有活血化瘀、化痰降浊等功效，适用于高脂血症属痰浊挟瘀证候者[1]。研究表明，荷丹片具有良好的降血脂作用，临床上常用于治疗动脉粥样硬化和高脂血症[2-4]。荷丹片的质量标准收载于《中华人民共和国药典》(2020年版)一部中(简称《药典》)，药典规定，以君药成分荷叶中的荷叶碱作为荷丹片的指标性成分，采用高效液相色谱法对其进行含量测定。对于中药复方制剂，样品前处理是整个分析过程中最重要的一个环节，主要是为了实现待测物的分离、提纯和富集，尽量排除其他物质或杂质的干扰，便于进一步分析。传统的处理技术主要有液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取(solid phase extraction, SPE)[5-6]。这些方法有机溶剂用量大、耗时长、成本高，对环境不利。近年来，基于LLE和SPE的特点和不足，分散微固相萃取技术(dispersive micro solid phase extraction，DMSPE)得到一定的发展[7-12]，其原理是将待净化提取液直接加入含有固体填料的离心管中，通过涡旋振荡离心等方式将待测目标物吸附于填料上，然后利用解吸附溶剂进行洗脱分析。目前，最常用的固体吸附填料有石墨烯、磁性碳纳米管、金属纳米粒子和离子交换树脂填料。

本研究基于荷叶中生物碱成分的结构特点，以强离子交换树脂填料(polymer cation exchange, PCX)作为吸附剂，采用DMSPE技术对荷丹片进行前处理，建立高效液相色谱法测定荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱含量的新方法。该前处理技术简便快捷，消耗溶剂少，净化效果好，单个样品的处理时间仅需3～5 min。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、三乙胺(优级纯)、冰醋酸(分析纯)、甲酸(分析纯)(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(分析纯，西陇化工股份有限公司)；水为超纯水，由Milli-Q纯水系统制备。

荷叶碱对照品(批号：111566，北京中国药品生物制品检定所)；N-去甲基荷叶碱对照品(含量≥99%)、O-去甲基荷叶碱对照品(含量≥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；荷丹片(批号：20150610，20141211，20150906，南昌济顺制药有限公司);高分子阳离子交换填料(polymer cation exchange,PCX)(天津博纳艾杰尔公司)。

1.1.2 仪器 液相色谱仪(LC-20A，日本岛津公司)；万分之一分析天平(AR 2140，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超声波清洗器(KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司)；快速涡旋混匀器(SK-1，常州国华电器有限公司)；超纯水系统(美国Milli-Q公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取O-去甲基荷叶碱对照品8.50 mg、N-去甲基荷叶碱对照品9.60 mg、荷叶碱对照品11.40 mg，置10 mL量瓶中，加适量甲醇溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.85、0.96和1.14 mg/mL的对照品储备液。分别精密吸取上述3种对照品储备液0.5、0.5、1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。

1.2.1.2 供试品溶液的制备 (1)提取。取荷丹片10片，除去包衣，精密称定，研细，取0.1 g，用甲酸-水-甲醇溶液(5∶28.5∶66.5)10.0 mL溶解，超声(功率250 W，频率40 kHz)提取30 min，静置至室温，过滤，残渣用酸水溶液多次洗涤至10.0 mL，摇匀，即得荷丹片提取液。(2)纯化。精密吸取1.0 mL荷丹片提取液，加入1.5 mL的装有25 mg PCX粉末的 EP管中，涡旋混匀30 s，转移至带有0.45 μm有机相滤膜的2.5 mL注射器过滤装置，弃去滤液，再用1.0 mL乙腈淋洗注射器过滤装置进行过滤，弃去滤液。用3.0 mL 5%的氨-乙腈溶液洗脱注射器过滤装置，收集洗脱液，供HPLC分析。

1.2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈和水-三乙胺-乙酸(100∶25.5∶1.1)，比例为30∶70；流速1.0 mL/min；检测波长270 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。分别精密吸取混合对照品溶液和荷丹片供试品溶液20 μL，按照上述色谱条件进行测定，结果见图1。荷叶碱在270 nm波长下与其相邻色谱峰的分离度均>1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，理论塔板数按荷叶碱色谱峰计算，不低于2 000。

1.2.3 方法学验证

1.2.3.1 标准曲线的制备与线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各个浓度的对照品溶液。分别精密吸取各个浓度的对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2 专属性考察 按照“1.2.1.2”项下的方法制备缺君药成分荷叶的阴性对照品溶液，按照“1.2.2”项下的色谱条件进行色谱分析(图1)。

1：O-去甲基荷叶碱；2：N-去甲基荷叶碱；3：荷叶碱。A：混合对照品；B：纯化前荷丹片提取液；C：纯化后荷丹片溶液；D：阴性对照。

1.2.3.3 仪器精密度试验 按照“1.2.2”项下的色谱条件，将同一份混合对照品溶液连续进样6次，分别测定O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.3.4 重复性试验 分别取同一批(批号：20150610)荷丹片粉末6份，按照“1.2.1.2”项的制备方法操作，按照“1.2.2”项下的色谱条件分别进样，测定峰面积，计算O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的含量及其RSD。

1.2.3.5 加标回收率试验 分别取9份已知含量的荷丹片片粉(批号：20150610，O-去甲基荷叶碱0.31 mg/g，N-去甲基荷叶碱0.35 mg/g，荷叶碱0.93 mg/g)约0.05 g，精密称定，分别加入O-去甲基荷叶碱含量对照品溶液(0.017 0 mg/mL)、N-去甲基荷叶碱对照品溶液(0.019 2 mg/mL)以及荷叶碱对照品溶液(0.045 6 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，按照“1.2.1.2”项下的方法制备，按照“1.2.2”项的色谱条件分别进样，测定峰面积，计算3个生物碱的含量，求得平均回收率。

1.2.4 DMSPE纯化条件的优化 在对荷丹片中生物碱类成分进行纯化时，基于DMSPE前处理技术的原理，对吸附填料PCX的用量、吸附时间、洗脱溶剂中氨/乙腈浓度和洗脱体积进行优化。

1.2.4.1 PCX用量的优化 准确量取同一份供试品提取液1.0 mL，加入装有10、15、20、25、30、35、40 mg PCX填料的1.5 mL的EP管中，按照“1.2.1.2”中的纯化方法进行纯化，收集洗脱液，供HPLC分析。每个PCX填料用量平行操作3份，结果取平均值。

1.2.4.2 吸附时间的优化 取同一份供试品提取液，按照“1.2.1.2”中纯化方法进行纯化，考察不同涡旋时间(15、30、60、90、120 s)对吸附率的影响。

1.2.4.3 洗脱剂中氨浓度的优化 分别取同一份供试品提取液1.0 mL，按照“1.2.1.2”中的纯化方法进行纯化，考察0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%的氨-乙腈溶液对生物碱的洗脱影响，收集洗脱液，供HPLC分析。每个浓度的氨-乙腈洗脱液平行操作3份，结果取平均值。

1.2.4.4 洗脱剂体积的优化 分别量取同一份供试品提取液1.0 mL，按照“1.2.1.2”中纯化方法进行纯化，考察不同洗脱剂体积(1、2、3、4 mL)对生物碱洗脱的影响，平行操作3份，结果取平均值。

2 结 果

2.1 方法学验证

2.1.1 标准曲线的制备与线性关系的考察O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱的线性相关系数为0.999 90～0.999 95，三者在各自线性范围内呈现良好的线性关系(表1)。

表1 3种生物碱的线性回归方程

2.1.2 专属性考察 阴性对照品溶液在O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的保留时间处未出现干扰峰，说明荷丹片中其他成分对于荷叶生物碱类成分的分析没有干扰(图1)。

2.1.3 仪器精密度试验 将同一份混合对照品溶液连续进样6次后，测得O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的峰面积的RSD为0.93%～1.56%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 分别取同一批(批号：20150610)供试品粉末6份，测得O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱含量的RSD分别为1.64%、2.16%和2.10%，结果表明方法重复性良好(表2)。

表2 重复性试验结果

2.1.5 加标回收率试验 测得的O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的平均加样回收率(n=9)为97.76%～98.93%，RSD为1.84%～2.72%(表3)。

表3 回收率试验结果

2.2 DMSPE纯化条件的优化

2.2.1 PCX用量的优化 PCX用量对纯化结果的影响见图2A，当PCX的用量从5 mg增加到25 mg时，3种分析物的吸附率随着PCX用量的增加而增大，但当PCX用量>25 mg时，继续增加PCX的用量，峰面积反而有所减少，可能是因为填料用量达到饱和状态后，过量的填料会增加生物碱死吸附的量。因此，选择25 mg作为PCX的最佳用量。

2.2.2 吸附时间的优化 吸附时间对纯化结果的影响结果见图2B，吸附率在涡旋30 s时达到最高，涡旋时间>30 s时，吸附效率未显著提高。因此，确定最佳吸附时间为30 s。

2.2.3 洗脱剂中氨浓度的优化 氨浓度对纯化结果的影响见图2C，在其他提取纯化条件均相同的情况下，不同体积分数的氨-乙腈洗脱液对荷叶碱的洗脱效果不同，当浓度从2%增加到5%时，碱性化合物荷叶碱从强阳离子交换吸附剂中缓慢地被洗脱出来，峰面积达到最大；继续增加氨-乙腈浓度，峰面积反而有所减少。因此，选择5%作为氨-乙腈的最佳洗脱浓度。

2.2.4 洗脱剂体积的优化 洗脱剂体积对纯化结果的影响见图2D，当洗脱体积达到3 mL时，洗脱剂中3种生物碱的峰面积达到最大。因此，认为3.0 mL洗脱液对于分析物的完全洗脱是足够的。

A：PCX用量的考察；B：吸附时间考察；C：氨浓度考察；D：洗脱剂体积考察。

2.3 供试品的测定 分别取3批荷丹片粉末，按照“1.2.1.2”项下供试品溶液的制备方法进行操作，按照“1.2.2”项下的色谱条件分别进样，测定峰面积，代入回归方程计算3种生物碱含量，结果见表4。

表4 荷丹片中3种生物碱的含量

2.4 与《药典》记载的前处理方法比较 取荷丹片片粉约0.4 g，精密称定，按《药典》中荷丹片项下含量测定中的“供试品溶液制备方法”进行制备，最终转移至100 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，滤过，取滤液按照“1.2.2”项下的方法进行分析，测得荷丹片中荷叶碱的平均含量为0.91 mg/g，与采用DMSPE纯化后的含量无显著性差异。

2.5 DMSPE的优点 为了解基质干扰和清除效果，在DMSPE纯化前后分别获得2张高效液相色谱图(图1)。从图1B可以看出，在没有DMSPE纯化的样品中，在10 min内(尤其是5 min内)可以观察到大量的干扰化合物，但是在所研究的色谱条件下，O-去甲基荷叶碱在5.67 min出峰，由于出峰的保留时间较早，很容易与干扰化合物共洗脱；同样，N-去甲基荷叶碱色谱峰也会受到干扰峰的影响，导致色谱峰的基线噪声提高，进而导致灵敏度降低。然而，当提取液进行了DMSPE纯化时，获得了更好的纯化效果，去除了干扰峰的影响，使O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱具有很好的选择性。

3 讨 论

荷丹片质量标准收载于《药典》，其含量测定采用HPLC法测定其君药荷叶中的荷叶碱，供试品溶液的处理方法是采用碱性三氯甲烷进行提取，此操作过程较为繁琐，且三氯甲烷的毒性和挥发性均较大，给操作带来不便。本研究建立了基于PCX填料的DMSPE-高效液相色谱法测定荷丹片中3种生物碱类成分的含量测定方法，其中DMPSE具有净化周期短、有机溶剂用量少、操作较简便等优点，经考察，该方法的精密度、重复性、稳定性均良好，专属性强，准确度高，可用于荷丹片中O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱的质量控制方法。