水晶冰菜总黄酮分级萃取及其抗氧化活性

孙美玲，冯晓光，常希光，陈湘宁*

(1.北京农学院 食品科学与工程学院 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206； 2.北京裕农优质农产品有限公司，北京 101400)

水晶冰菜 (Mesembryanthemumcrystallinum) 为番杏科 (Aizoaceae) 日中花属 (Mesembryanthemum) 中一种一年生或二年生矮生肉质草本植物，又称冰叶日中花、冰草、冰花等，其原产自南非纳米比亚沙漠等干旱地区，此后广泛分布于加勒比海周边、环地中海沿岸和澳大利亚西部等国家和地区，近年来才逐渐引入中国，成为了一款倍受消费者青睐的新型绿色蔬菜[1-2]。水晶冰菜的茎叶鲜食有淡淡的咸味，具有生津止渴、清热解毒、利湿助消化的功效[3]，含有钠、钙、钾、胡萝卜素等矿物质和氨基酸、多酚、黄酮、抗酸化物等功能性物质[4]，其中黄酮类化合物在生物活性方面发挥了重要作用。李婷婷[5]的研究表明：水晶冰菜总黄酮具有心血管保护功能、增强机体免疫力功能、抗氧化、抗肿瘤和抑菌功能等，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水晶冰菜购自永旺超市(永旺国际北清路店)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、甲醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、邻苯三酚、水杨酸、硫酸铁、过氧化氢均为分析纯，购自北京畅华志诚科技有限公司。芦丁标准品(HPLC≥98%)，购自北京中科生邦有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 水晶冰菜总黄酮的制备 参考高林晓等[10]的方法稍作修改，将新鲜的水晶冰菜清洗干净，烘干水分后碾碎，过孔径0.25 mm的筛子得水晶冰菜干粉末。按照1∶25的料液比加入体积分数为70%乙醇溶液，磁力搅拌30 min，在60 ℃的超声机中以250 W的功率超声120 min，10 000 r/min离心15 min，残渣重复提取2次，合并上清液即为水晶冰菜总黄酮粗提液，旋转蒸发至无醇味，低温冷冻干燥24 h，得水晶冰菜总黄酮粗提物M1(以下简称粗提物)，称量。

1.2.2 水晶冰菜总黄酮萃取物的制备 参考李现日等[11]的方法稍作修改，按照1.2.1的方法制得水晶冰菜总黄酮粗提液，旋转蒸发至无醇味，在分液漏斗中加入等量石油醚充分摇匀，30 min后收集悬于上层的石油醚组分，下层依照上述方法重复萃取2～3次。将剩余部分按上述步骤依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，即得不同极性萃取组分和水相，收集相同组分分别旋转蒸发以除去有机溶剂，低温冷冻干燥24 h，得到不同极性萃取物M2、M3、M4、M5，称量。

1.2.3 不同极性萃取组分总黄酮含量的测定 参考荆常亮[12]的方法加以修改，采用NANO2-AL(NO3)3比色法，得到芦丁标准曲线回归方程：y=0.102 1x+0.000 2，R2=0.999 8。参考李亚军[13]等的方法，按下式计算不同萃取组分中总黄酮含量：

式中，C为黄酮的质量浓度，mg/mL；V为复溶液体积mL；W为冻干粉质量g；Y为总黄酮的含量mg/g。

1.2.4 水晶冰菜总黄酮抗氧化活性试验

1)DPPH·清除率的测定。参考陈建福等[14]的方法稍作修改，将M1、M2、M3、M4、M5用去离子水配置成不同浓度的样品溶液，以同等浓度的维生素C标准品做阳性对照，分别测定各组样品溶液对DPPH·的清除率。

2)·OH清除率的测定。参考李彩云等[15]的方法稍作修改，将M1、M2、M3、M4、M5用去离子水配置成不同浓度的样品溶液，以同等浓度的维生素C标准品做阳性对照，分别测定各组样品溶液对·OH的清除率。

2 结果与分析

2.1 不同极性萃取组分的质量和总黄酮含量

由图1可知，粗提物的质量显著高于各极性萃取组，可能是其中含有大极性的成分，各萃取组分的质量从大到小依次为：水相、正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相，该结果与李现日等[11]对金花葵花黄酮不同溶剂萃取物质量的对比结果大致相同。练冬梅[17]等采用传统方法测定了水晶冰菜中总黄酮成分为24.5 mg/g，本试验先对原料进行反复冻融处理再用超声辅助法提取到的黄酮含量为27.76 mg/g，这可能与原料来源不同相关；大部分原因在于试验方法，反复冻融处理能够有效裂解细胞，利于细胞内溶物的溶出，同时在超声波产生的空化、振动、粉碎等综合效应的影响下，植物细胞壁遭到破坏，细胞通透性增加，不仅加速黄酮类化合物成分的扩散速度，也增加了提取溶剂的穿透能力，导致总黄酮提取率显著提升[18]。由图1折线图走势可知，经不同极性溶剂萃取后各相中总黄酮含量差异显著，其中正丁醇相中总黄酮含量最高，是粗提物总黄酮含量的1.31倍；其次是乙酸乙酯相，是粗提物的1.26倍，水相中总黄酮含量最低，该结果与余付香[19]等对赶黄草不同溶剂萃取物黄酮含量的研究结果不一致，原因可能是不同原料所含黄酮类化合物的极性部分与极性溶剂的极性不同，本试验结果表明水晶冰菜总黄酮的极性部分与正丁醇的极性最相似。

2.2 不同极性萃取组分对DPPH·清除率分析

由图2可知，在0～0.12 mg/mL质量浓度范围内，不同极性萃取组分对DPPH·的清除能力逐渐加强，这也进一步说明植物中总黄酮的抗氧化活性与其含量相关[20]。同一浓度下，不同极性萃取组分对DPPH·的清除率从大到小依次为正丁醇相、乙酸乙酯相、粗提物、石油醚相，与组分中总黄酮含量趋势一致。当质量浓度为0.10 mg/mL时，各组分对DPPH·的清除率分别为83.58%、75.16%、68.32%和53.43%，而且在0.04 mg/mL时，正丁醇相和乙酸乙酯相就已经分别达到了64.99%、60.68%的清除率，而石油醚相的清除率仅为正丁醇相的一半，原因可能是水晶冰菜不同极性萃取组分中黄酮类化合物的结构、种类和含量存在差异。粗提物的清除率明显低于正丁醇相和乙酸乙酯相，推测原因是粗提物中含有大量杂质，可能会与抗氧化成分发生拮抗作用[21]。

2.3 不同极性萃取组分·OH清除率分析

由图3可知，在0～0.12 mg/mL质量浓度范围内，不同极性萃取组分对·OH清除率的趋势和DPPH·一致，而且正丁醇相的清除率和维生素C无限接近，显著高于其余相，原因可能是该相萃取组分中还含有抗氧化能力较强的多糖、多酚、萜类化合物，并且纯度要高于粗提物[22]。

2.4 不同极性萃取组分清除率分析

2.5 不同极性萃取组分抗氧化活性对比分析

表1 不同极性萃取组分的抗氧化活性评价Tab.1 Antioxidant activities of extracts with different polarity

3 结 论