非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

蒋思文，房立春，冯泽新，焦 鹏，王玥超，梁 艳，史东宇，陈 青*

(1.北京农学院 生物与资源环境学院/ 农业农村部华北都市农业重点实验室，北京102206；2.山东省农业科学院，济南250100)

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfarviridae)的大型包膜病毒，也是唯一已知的虫媒DNA病毒，主要在胞质中完成复制和组装[1,2]。ASFV病毒粒子具有双层囊膜结构，呈二十面体形态，平均直径200 nm，不同分离株的双链DNA长度范围在170 ～ 193 kbp之间[3, 4]，编码150～200种蛋白质，其中包括负责调节病毒和宿主细胞功能的相关蛋白[5, 6]。

ASFV的I215L基因编码一个与泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC，E2)高度同源的基因序列，且在大肠杆菌中表达时具有UBC活性。它在纯化的泛素激活酶(E1)和ATP存在下与泛素分子形成硫醚键，随后将泛素转移到特定的蛋白质底物上[7]。这是迄今为止报道的唯一一个由病毒基因编码的具有功能活性UBC酶，故将ASFV的I215L基因产物称为泛素结合酶(UBCv1)[7-9]。重组UBCv1在体外可以自泛素化，也可以泛素化组蛋白以及ASFV病毒粒子核壳多蛋白pp62[10]。最新研究发现了病毒UBCv1与宿主发生互作的蛋白，Barrado推测UBCv1通过影响mTORC信号通路、调节宿主翻译机制及ASFV生命周期中细胞蛋白的表达发挥作用，但具体机制仍不清楚[9]。本文作者将ASFV的I215L基因克隆至原核表达载体中构建UBCv1重组质粒，低温诱导表达、亲和标签纯化该蛋白，并在此基础上制备多克隆抗体，为非洲猪瘟病毒UBCv1蛋白生物学功能的深入研究提供材料，并为ASFV致病机理研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

pET-28a载体、p3XFLAG-CMV-7.1-I215L载体由北京畜牧兽医研究所兽医公共卫生创新与管理团队提供；大肠杆菌DH5α感受态细胞和BL21(DE3)感受态细胞均购自TIANGEN公司；6～8周龄的BALB/c小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物实验均通过北京农学院实验动物福利与伦理审查(BUA2021028)。BamH I、HindIII限制性内切酶、DNA Ligation Kit、2×PrimeSTAR® Max DNA Polymerase均购于TaKaRa生物公司；IPTG、His-tag抗体(小鼠单抗)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TIANgel Midi Purification Kit、DAB显色试剂盒购自TIANGEN公司。

1.2 I215L基因的扩增与重组质粒的构建

以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板(其中I215L基因根据ASFV Georgia 2007/1株I215L序列(Gene ID:FR682468.1)合成)，以序列5′CGCGGATCCATGGTTTCCAGGTTTTTAATAG 3′(下划线处为BamH I 酶切位点)和序列5′CCCAAGCTTTTACTCATCATCCTCCTCCTCTTC 3′(下划线处为HindIII酶切位点)为引物进行PCR扩增。反应结束后用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，将含有I215L片段的胶块，用试剂盒回收，回收产物用BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经纯化回收；pET-28a做同样处理后，将二者连接。连接产物转化于E.coliDH5α，用含卡那霉素平板过夜培养进行筛选，挑取单菌落扩增培养后提取质粒，PCR及双酶切鉴定后由公司测序，验证序列的正确性。

1.3 诱导表达重组蛋白

用构建好的pET-28a-I215L质粒和pET-28a对照分别转化E.coliBL21(DE3)，用含卡那霉素的平板过夜培养进行筛选，挑取单菌落于液体LB振荡培养后，再以1∶100的体积比将活化的菌液扩大培养，将600 nm光下吸光度为0.6～0.8的菌液，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，16 ℃条件下分别诱导10 h、21 h、24 h，离心收集菌体，PBS重悬菌体后超声破碎至澄清，分别收集全菌液、沉淀、上清进行SDS-PAGE电泳，对其表达情况与可溶性进行分析。

16 ℃下IPTG诱导24 h的重组菌和阴性对照菌破碎上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转印至PVDF膜，封闭液4 ℃封闭过夜，加入抗His标签的小鼠单抗(1∶1 000)稀释液作为一抗，4 ℃孵育2 h；洗涤后，用HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀释液作为二抗，4 ℃孵育2 h；洗涤后，加DAB底物进行显色，对重组蛋白进行Western blot鉴定。

1.4 表达蛋白的纯化与鉴定

大量表达蛋白质后，参照BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin试剂盒说明书纯化蛋白，离心收集菌体，用无菌的PBS洗涤2遍后，用裂解液重悬菌体，加入溶菌酶至终质量浓度1 mg/mL，冰上放置30 min，超声破碎后离心收集上清液，将上清加入预先处理好的Ni-NTA填料于4 ℃结合2 h，用1倍柱体积含5 mmol/L咪唑的洗涤液洗涤杂蛋白，洗柱5次，再用含有300 mmol/L的咪唑的Tris缓冲溶液(pH = 8.0)洗脱，收集洗脱液。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，封闭液4 ℃封闭过夜，加入抗His标签的小鼠单抗(1∶1 000)稀释液为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)稀释液为二抗，对纯化重组蛋白进行Western blot分析。

1.5 多克隆抗体的制备

将50 μg纯化重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，在BALB/c小鼠背部皮下多点注射进行首免，同时对照组接种等量体积的PBS。首免后14 d、28 d和42 d，分别将50 μg纯化重组蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后进行加强免疫。四免后7 d小鼠眼眶取血，收集血清。

1.6 多克隆抗体效价的测定

采用方阵滴定法，将纯化的UBCv1稀释为质量浓度3 μg/mL包被酶标板，每孔加入100 μL，4 ℃包被过夜；洗涤液洗涤后以含1% BSA的封闭液37 ℃封闭2 h；再用洗涤液洗涤。将不同稀释度的多抗(1∶90 000、1∶270 000、1∶810 000、1∶2 430 000、1∶7 290 000、1∶21 870 000、1∶65 610 000)和阴性血清稀释液作为一抗，每孔加入100 μL，37 ℃保温1 h；洗涤液洗涤。二抗为稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，每孔加入100 μL，37 ℃保温1 h；洗涤液洗涤。每孔加入100 μL TMB显色液，37 ℃避光反应15 min后加入100 μL终止液(2 mol/L硫酸)终止反应。用酶标仪测定450 nm处吸光值，记录并分析。

1.7 多克隆抗体的Western Blot鉴定

将纯化的重组蛋白和阴性对照在同一凝胶上进行SDS-PAGE电泳后，采用湿转法转印到PVDF膜上，经过洗涤、封闭后，采用本文制备的多克隆抗体稀释液(1∶1 000)作为一抗，37 ℃孵育1 h；洗涤后，用HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀释液作为二抗，37 ℃孵育2 h；洗涤后，加DAB底物进行显色，拍照记录并分析结果。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建与鉴定

对重组质粒pET-28a-I215L进行PCR鉴定，得到639 bp的条带(图1)，与预期片段大小一致；经HindIII和BamH I双酶切，得到两条条带，大小约为5 500 bp和650 bp，条带大小分别与载体5 369 bp及目的基因639 bp大小一致(图1)。对阳性质粒进行测序，测得序列经BLAST分析，与ASFV Georgia 2007/1参考毒株的I215L序列一致。

2.2 UBCv1的诱导表达及可溶性分析

SDS-PAGE结果表明，IPTG终浓度1 mmol/L时，16 ℃诱导0 h、10 h、21 h、24 h后，在预测的28 kDa位置，出现一条逐渐加深的条带，与预期大小相符(图2)，并经Western blot验证，28 kDa位置处出现特异性条带(图2)，表明UBCv1获得了正确表达。通过菌体裂解液上清、沉淀条带结果可知，UBCv1以可溶性表达为主(图2)。

2.3 UBCv1的纯化及鉴定

利用带His标签的填料来纯化重组UBCv1，纯化后进行SDS-PAGE、Western blot鉴定，由图3可知，纯化后出现特异的条带，约28 kDa，与预期目的条带大小一致。

2.4 重组蛋白多克隆抗体效价的检测

以纯化的UBCv1为包被抗原，倍比稀释后包被酶标板，采用间接ELISA 法测定UBCv1的鼠源多克隆抗体效价。以阳性孔OD值(P)与阴性孔OD值(N)的比值大于2.1的最高稀释度为多抗效价。结果表明，纯化后的多抗效价为1∶7 290 000。以制备的多克隆抗体作为一抗，进行Western blot检测，28 kDa处出现明显条带(图4)，说明多克隆抗体能够特异性识别ASFV的UBCv1。

3 讨 论

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)所致的一种烈性病毒性的猪传染病，它主要具有高急性、高热、高毒和高病死率等临床症状和传染特点，目前已经扩散到非洲、亚洲和欧洲的许多国家和地区[11]。尽管近些年来，对ASFV的致病机制、入侵机制、病原与宿主互作和免疫逃逸机制等方面的研究有了很大的进展，但仍存在许多未知领域亟待深入研究。

泛素化是一种蛋白质翻译后修饰，可以介导蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径进行选择性降解，进而广泛地调控细胞的转录、信号转导、细胞周期调控等过程[12, 13]。泛素结合酶(E2)又称为泛素载体蛋白，可将激活的泛素分子从泛素活化酶(E1)转移至E2。与E2结合的泛素分子进一步被转移至泛素连接酶(E3)所识别的特异底物蛋白质上[14]。在病毒感染过程中，很多病毒利用泛素化修饰启动免疫逃逸，如疱疹病毒、痘病毒等大型DNA病毒可借助其编码的E3泛素连接酶或去泛素化酶逃避宿主的先天免疫系统，促进病毒的复制传播[15, 16]。

UBCv1是ASFV一种非常早期的病毒蛋白，其表达不依赖于病毒DNA复制，感染早期定位于细胞核之中，感染晚期在细胞核及细胞质中均有表达，这表明UBCv1随着ASFV感染进程可以在细胞核和细胞质之间动态穿梭[9]。UBCv1在ASFV感染中发挥了关键作用，通过劫持细胞泛素-蛋白酶体系统，调节宿主蛋白及其自身蛋白的功能和亚细胞定位。ASFV很可能利用UBCv1干扰泛素机制，从而调节多种病毒机制(如转录、复制和衣壳化)和细胞功能(如抗病毒应答、DNA损伤应答、凋亡)[17]。

UBCv1是目前已知的唯一病毒泛素结合酶(E2)，因此该蛋白科学价值很高[10]。早期，有人报道了UBCv1影响细胞核蛋白SMCy的活性，但意义未知[18]；最近又有人报道了UBCv1与宿主细胞的40S核糖体蛋白RPS23，翻译起始因子eIF4和细胞连接酶Culin 4B有相互作用，推测UBCv1会影响mTORC信号通路、宿主翻译机制等细胞过程，但具体机制仍不清楚[9]。

本文作者利用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒泛素结合酶(UBCv1)，针对ASFV的I215L基因，采用了含有His标签的pET-28a原核生物表达载体，构建了UBCv1的重组质粒，低温诱导BL21(DE3)表达UBCv1的重组蛋白，可溶性表达，经过His标签纯化柱纯化后，免疫小鼠制备多克隆抗体，ELISA检测多抗效价，效价较高，可为非洲猪瘟病毒UBCv1蛋白生物学功能及病毒相关致病机制的深入研究提供重要的生物材料。