辅助生殖技术助孕后子代哮喘发生风险的Meta分析

王舒可,郑梅玲

随着现代医学的进步，越来越多的不孕夫妇通过辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)解决了生育问题。从该技术应用至今，全球约有800万婴儿通过ART助孕降生[1]，然而ART是否会对子代健康产生影响一直是人们关注的重点[2]。有研究称体外受精(in vitro fertilization，IVF)的子代相对自然受孕(naturally conceived，NC)子代来说，其多胎妊娠、新生儿低体重、早产及剖宫产等围产期并发症发生率增加[3-4]，ART子代躯体畸形发生率、甚至远期躯体患病率高于NC子代[5]，可见于多种系统疾病，如脑瘫、运动障碍、哮喘、癌症等[6]。针对ART与子代哮喘患病率相关性，Carson等[7]发现借助不孕治疗出生的子代哮喘发生率高，但也有学者未发现明显相关性[8]。由于各研究单个样本量较小，ART技术对子代哮喘的发生是否有影响目前尚未明确，因此本研究对近年来国内外已公开发表的研究依照流行病学观察性研究Meta分析(MOOSE)指南进行系统评价，旨在分析ART与子代哮喘发生率的相关性，为更深入认识ART安全性及预后等方面提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 检索策略及纳入标准

通过计算机检索PubMed、EMbase、Cochrane library等外文数据库以及维普(VIP)、中国知网全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)和万方等国内数据库，搜索ART与子代哮喘相关的观察性研究，检索时间从2000年1月至2020年7月，并进行人工检索参考文献减少漏检。(中文检索词：辅助生殖技术、体外受精-胚胎移植、卵细胞胞浆内单精子注射、子代、儿童、后代、哮喘等；英文检索词：Reproductive Technique、In Vitro Fertilization、IVF、Embryo Transfers、Intracytoplasmic Sperm Injection、ICSI、Children、Offspring、Asthma等)。所有检索采用主题词[MEDLINE(MeSH)、EMbase(EMTREE)]与自由词相结合的方式。纳入的研究类型为ART与子代哮喘发生率关系的观察性研究；观察终点为子代哮喘发生率。排除文献重复的研究、基础研究、系统评价、个案报道、会议摘要及非观察性研究；无相关结局指标或无法获取有效数据的研究。

1.2 文献筛选和资料提取

按照纳入与排除标准，由2位研究员独立进行文献筛选，按照统一设计的资料信息表提取信息并互相核对，当存在分歧时，可进行讨论或由第三方协商来解决。文献筛选时首先阅读题目，无关文献排除后，再进行文献摘要及全文阅读来确定是否纳入。资料信息提取包括第一作者、发表时间、国家、子代数、受精方式、研究类型、评估时子代年龄、子代胎数、结局指标，并逐一交叉核对。如果研究的数据资料不完整，则与该作者取得联系，若未获得有效数据，则将其剔除。

1.3 研究质量评价

采用Newcastle-Ottawa scale(NOS)量表对纳入研究进行质量评分，评分满分为9分，分为低质量(0～4分)、高质量(5～9分)，评分标准如下：① 选择性(a.RE——暴露队列的代表性；b.SNE——非暴露组选择；c.AE——暴露的确定；d.DO——研究对象在研究开始前无结局事件)；② 可比性(a.SC——年龄、胎数的控制；b.AF——其他混杂因素的控制)；③ 结局(a.AO——结局事件的评估；b.FU——随访是否充分；c.AFU——随访的完整性)。并互相核对结果。

1.4 统计学分析

采用RevMan 5.3和Stata 14.0软件进行Meta分析。纳入研究结果间异质性的检验采用Cochrane Q检验及I2检验，若P≥0.05说明研究间同质性较好，反之认为有异质性；根据I2值进一步将异质性划分为低(25%)、中(50%)、高(75%)3个等级。如果研究间同质性较好，则以固定效应模型合并，反之选用随机效应模型，并通过metaninf法对其异质性来源进行分析，计数资料采用优势比(odds ratio，OR)为效应量，提供95%可信区间(Confidence intervals,CI)，P<0.05为差异有统计学意义，并根据子代胎数、受精方式及子代年龄进行亚组分析。用漏斗图来检验是否存在发表偏倚，用Begger’s检验和Egger’s检验来定量评估发表偏倚，P>0.05提示无显著发表偏倚。

2 结果

2.1 文献检索结果

共检索到文献1 710篇，最终纳入12篇文献[7-18]进行Meta分析，均为英文文献。文献筛选流程及结果见下页图1。纳入的研究中，前瞻性研究4篇[7,9,13,15]，其余8篇为回顾性研究。纳入文献的一般资料信息与质量评分见下页表1、表2。

表1 纳入研究的基本特征及质量评价

表2 纳入研究的质量评价

图1 文献筛选流程图

2.2 辅助生殖技术对子代哮喘发生率的影响

对纳入的12项研究进行Meta分析，共计3 174 605例子代。进行异质性检验得，I2=92%>50%，且Q检验的P<0.05，因此采用随机效应模型。Meta分析结果显示，与NC组子代相比，ART组子代哮喘发生率更高，差异有统计学意义[OR=1.37，95%CI(1.11-1.70)，P<0.05]，详见下页图2。

图2 ART组与NC组子代哮喘发生率的Meta分析

2.3 敏感性分析

为了评估各研究对结果的影响，采用metaninf法对每一项研究进行分析，结果如下页图3-A所示，发现Källén 2013[10]对异质性影响较大，该研究样本量超过200万，与其他研究样本量差异较大，在剔除本研究后，异质性显著降低，且研究结果未发生方向性改变，结果如下页图3-B所示，剔除任意其余的研究均不会显著影响结果，因此将此剔除后进一步行亚组分析。

图3 Metaninf法敏感性分析森林图

2.4 亚组分析

2.4.1 按照不同子代胎数(单胎[7,9,11-16]、多胎[9,14,18])纳入数据，结果显示：单胎组间无明显异质性(I2=28.5%，P>0.05)，用固定效应模型进行分析，发现ART组的单胎子代哮喘发生风险较NC组明显增加,差异有统计学意义[OR=1.20，95%CI(1.10-1.32)，P<0.05]；多胎子代亚组间无明显异质性(I2=0.0%，P>0.05)，ART组的多胎子代哮喘发生风险较NC组明显增加，差异有统计学意义[OR=0.90，95%CI(0.67-1.20)，P<0.05]，详见图4。

图4 不同胎数ART组与NC组子代哮喘发生率的Meta分析森林图 图5 IVF/ICSI组与NC组子代哮喘发生率的Meta分析森林图

2.4.2 针对单胎子代，按照受精方式的不同，分为IVF组(5篇[9,11,13-15])与ICSI组(3篇[13，15-16])进行亚组分析，结果显示：两组间均无明显异质性(IVF组：I2=32.3%，P>0.05；ICSI组：I2=0%，P>0.05)，用固定效应模型进行分析，与NC组相比，IVF组与ICSI组的子代哮喘发生率均增加[OR=1.21，95%CI(1.10-1.32)，P<0.05]vs[OR=1.42，95%CI(1.07-1.88)，P<0.05]，且ICSI组较IVF组对子代哮喘发生率的影响更显著，差异均具有统计学意义，详见图5。

2.4.3 为进一步根据年龄对单胎子代进行亚组分析，纳入的研究子代年龄段均在0～9岁之间，将其以5岁为分界，分为0～5岁组共4篇[7,12，15-16]，6～9岁组共3篇[7，11,13]，各组间均无明显异质性(两组I2=0%，P>0.05)。采用固定模型分析结果显示：相比NC组来说，ART组的0～5岁及6～9岁子代哮喘发生率增加[OR=1.50，95%CI(1.10-2.04)，P<0.05]vs[OR=1.23，95%CI(1.11-1.36)，P<0.05]，差异均有统计学意义。且从结果中可看出，ART对0～5岁子代发病率的影响更大，详见图6。

图6 不同年龄ART组与NC组子代哮喘发生率的Meta分析森林图

2.5 发表偏倚分析

采用Stata14.0软件绘制12项研究的漏斗图来考察本次研究是否存在发表偏倚，漏斗图对称意味着不存在发表偏倚(Begg’s test:P=0.150>0.05，Egger’s test：P=0.4>0.05),提示不存在明显的发表偏倚，详见图7。

图7 发表偏倚分析漏斗图

3 讨论

儿童哮喘是一种严重影响小儿身心健康的呼吸系统疾病，近年来发病率及死亡率均呈上升趋势[19]。最近的流行病学研究提示，剖宫产分娩、新生儿早产、低体重都是儿童哮喘发生的危险因素[20]，而ART导致的多胎妊娠会增加以上风险的发生[21]。目前临床医生已经限制每次胚胎移植数量，希望在不影响受孕结局的情况下降低多胎妊娠发生率。但即使单纯就单胎子代而言，ART助孕单胎子代的早产、低体重、剖宫产及畸形的发生率仍高于NC子代[22-23]。有研究统计，除小儿哮喘以外，ART助孕子代在儿童时期，因神经系统疾病、消化系统疾病、过敏性疾病等住院概率明显高于NC子代[14]，甚至有研究认为[24-25]，通过ART出生儿童癌症的发生率也可能高于正常受孕出生的儿童，因此ART安全性问题变得尤为重要。造成ART子代健康问题的原因有很多，至今尚不能完全阐明，已知的原因可能包括ART技术中相关操作，如卵泡刺激时激素的使用、配子胚胎的冷冻及解冻过程、技术中机械操作等都会对胚胎质量造成一定的影响，促排卵过程中，跳过优势卵泡的自然选择、母体内过高的激素环境，以及配子在取卵后暴露在自然环境及人造培养基中，都可能会导致胚胎表观遗传的改变，影响胚胎质量及子代健康。Kuiper等[11]对比了促排卵IVF(COH-IVF)与自然周期IVF(MNC-IVF)子代儿童期哮喘发生率的差异，发现COH-IVF子代哮喘发生率明显增加,而MNC-IVF与NC子代患哮喘的概率却无明显差异，提示IVF的促排卵过程可能是子代哮喘发生的危险因素。Magnus等[13]认为，哮喘的发生与免疫系统紊乱相关，而部分因为免疫因素相关造成不孕的行ART治疗的夫妇，其自身因素可能参与了子代哮喘的发生，但仍需排除其他因素后进一步明确二者之间的关系。

本次Meta分析最终纳入了12项ART与子代哮喘发生率相关的观察性研究，由于受到子代因素的影响，研究之间异质性较大，因此先采用随机效应模型进行分析，结果显示ART助孕子代哮喘发生率高于NC子代。为了分析子代胎数、年龄及受精方式对结果的影响，我们进行了亚组分析，经敏感性分析排除了1篇对异质性影响较大的研究后，胎数亚组中ART的单胎子代哮喘发生率较NC组增加，且组间的异质性较总异质性减少，进而可以解释之前的异质性可能来源于子代胎数的差异，由于胎数不同，会影响孕周、分娩方式及新生儿体重等多种指标，从而形成偏倚，在排除了胎数差异后，更能准确反映ART对子代哮喘发病的影响。对于不同年龄的单胎子代，ART组较NC组子代的发病率都增加，且对0～5岁子代哮喘发生的影响更大。另外，受精方式的差异可能也对子代健康造成不同影响，与IVF技术相比，ICSI技术主要适应证多为男性因素的不孕，包括少弱精子症、部分无精症等，而这些精子质量差，其染色体微缺失发生率增加，可能会导致子代染色体异常、畸形等，如泌尿生殖系统畸形[15]。有学者认为，在新鲜周期中，ICSI组较IVF组子代先天性心脏病发生率显著增加[26]。因此本研究将IVF组、ICSI组分别与NC组进行比较，发现ICSI组对单胎子代哮喘发病的影响大于IVF组，其原因可能包括男性因素、单精子胞浆内注射时的机械操作、有创性辅助孵化等对胚胎造成的干扰，未来需进行更多的实验研究加以确定。

本研究存在的局限性：① 只纳入了英文文献，可能存在语言偏倚；② 纳入资料均为公开数据，文献检索可能不全；③ 由于部分研究未按照其他危险因素进行亚组分析，因此可能存在偏倚风险；④ 纳入的研究并非全为前瞻性研究，可能因主观因素引起偏倚差异。⑤ 纳入的研究未对可能影响子代哮喘发生的因素进行研究分析，如：父母是否有吸烟史、是否患有哮喘等，这可能影响结果的准确性。

综上所述，当前分析结果表明，ART助孕的子代患哮喘的风险高于NC子代，提示ART可能是子代哮喘发生的危险因素之一。ART技术发展到今天仅几十年的时间，关于ART技术对子代远期健康的影响认识尚浅，尽可能减少ART的并发症，更精准地控制ART助孕的每一个步骤，是我们在保证助孕结局的同时，不可忽视的重点。

利益冲突声明：无利益冲突。