1例13号染色体复杂嵌合型结构畸变的细胞遗传学分析

李显筝 许玲 蔡婵慧 胡晶晶

（广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东 广州 511442）

绒毛染色体核型分析是孕早期常见的产前诊断方法之一。相对于羊水染色体核型分析，绒毛核型分析更容易出现嵌合体，而这些嵌合体有些是真性嵌合，有些是假性嵌合，如何鉴别和预测这些嵌合体对胎儿的风险，是产前诊断中的一大难题［1］。目前，临床上绒毛嵌合体多数为非整倍体数目异常嵌合，染色体结构重排畸变嵌合比较少见（79.3%vs 20.7%）［2］。本文将探讨1例13号染色体复杂结构畸变的嵌合体病例，并深入探讨其可能发生的机制。

1 对象与方法

1.1 对象 孕妇，43岁，2019年3月27日来本院就诊。末次月经为2018年12月19日，于2018年12月23日通过体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization／intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF／ICSI-ET）手段植入2枚冷冻胚胎，早期超声提示存活1枚。2009年顺产一女，现体健，平素月经规则，无特殊，夫妻双方外周血染色体核型均正常。孕12＋周左右，超声提示宫腔内单活胎，胎儿颈项透明层厚度（nuchal translucency，NT）4.7mm。就诊完善相关检查，孕妇及家属签署知情同意书，于孕14＋周，经腹B超行绒毛膜穿刺术，同时送检绒毛染色体核型分析及染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）检测。因绒毛染色体结果提示嵌合体，孕妇于孕18＋周，经腹B超行羊膜腔穿刺术，再次送检羊水核型分析及CMA检测。

1.2 方法

1.2.1 绒毛染色体核型分析孕11～15周孕妇在B超介导下经腹穿刺绒毛20～30mg，用无菌生理盐水清洗干净后，送至无菌培养室，于解剖显微镜下挑选出绒毛组织，经无菌手术刀剁碎和酶消化后，接种到3个培养瓶中，培养观察，1瓶进行原位收获、制片，1瓶传代、收获和制片，另1瓶留作备份继续培养，于显微镜下分析计数核型，若出现嵌合现象时加大计数量并对备份培养瓶中的细胞进行传代、收获和制片，加数尽量多的核型进行分析。

1.2.2 羊水染色体核型分析本中心采用原位羊水细胞培养法，孕妇于孕18～24周在B超介导下经腹穿刺羊水30ml，双人双线操作，接种2个培养瓶和2个培养皿，常规羊水培养，将2个培养瓶进行原位收获和制片，显微镜下计数15个细胞克隆，分析5个核型，若出现嵌合现象时加大计数量并对2个备份培养皿中的细胞进行传代、收获和制片，加数尽量多的核型进行分析。

1.2.3 CMA检测签署知情同意书后，采集孕妇绒毛或羊水。使用Agilent公司生产的8×60K芯片进行全基因组范围的不平衡现象检测。整个过程严格按照标准化操作进行，包括DNA的提取、酶切、连接、PCR、纯化、片段化、标记、杂交、扫描和分析。最终以正常男性DNA作为对照标准，利用Ch AS软件进行分析。

2 结果

2.1 经腹超声结果经腹部超声扫查提示：子宫增大，宫腔内见一胎儿回声，头臀径63mm，可见胎心搏动，胎儿NT4.7mm，胎盘位于子宫前壁，厚16mm，胎盘成熟度0度，羊水暗区31mm，子宫宫底壁见1个低回声团，大小约23mm×12mm，边界清，内部回声分布均匀，图1。

图1 超声结果：NT4.7mm

2.2 染色体G显带核型结果绒毛染色体核型分析共发现3种异常核型：①46，XX，del（13）（q22）；②46，XX，-13，＋mar；③46，XX，add（13）（q22），均涉及13号染色体，嵌合比例分别为50%、30%和20%，图2A-C，羊水染色体核型分析结果为46，XX，del（13）（q31.1），胎儿仅存在一种异常核型，图2D。

图2 染色体核型结果

2.3 染色体微阵列检测结果绒毛染色体微阵列结果提示：arr［hg19］10q22.1q26.3（70，857，961-135，426，386）x2-3，13q22.1q34（74，346，851-115，107，733）x1-2，发现胎儿存在两种基因拷贝数的变化：①10号染色体10q22.1-q26.3位置发生嵌合重复（比例约23%），片段大小约64.6Mb，包含616个基因；②13号染色体13q22.1-q34位置发生嵌合缺失（比例约40%），片段大小约40.7Mb，涉及251个基因，图3A。

羊水染色体微阵列结果提示：arr［hg19］13q31.1q34（84，336，388-115，107，733）x1，发现胎儿13号染色体13q31.1-qter位置发生缺失，片段大小约40.7Mb，涉及251个基因，其中97个为OMIM基因，图3B。

图3 染色体微阵列结果

3 讨论

绒毛是胚胎和母体进行物质交换的重要组成部分［3］。绒毛染色体核型G显带分析技术在临床中具有早发现、早干预、降低孕妇心理及身体创伤等优点，但其技术手段仍存在一定的弊端［4］。众所周知，胎盘由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成，羊膜和叶状绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，叶状绒毛膜是绒毛穿刺的目标物［5］；底蜕膜构成胎盘的母体部分，绒毛穿刺时不慎抽到底蜕膜是造成母体组织污染的主要原因［6］。同时，由于绒毛取材过程中易污染、取材难度大、绒毛量多少不同、孕周不同、培养时间长短等因素，对最终绒毛染色体结果都会造成不同程度的影响［7］。

绒毛检查所取标本主要为滋养细胞及绒毛间质细胞，虽然与胎儿来源于同一个受精卵，属于胎盘的一部分，但其并非真正的胎儿组织。在胚胎发育至64个细胞胚泡阶段，4个细胞发育成胎儿，12个细胞发育成胚外中胚层，其余48个细胞发育成滋养层，在胚胎发育早期，理论上非胎儿结构比胎儿更容易发生有丝分裂错误［8］。一般情况下绒毛核型能代表胎儿核型，但也可能由于母体组织污染或者限制性胎盘嵌合体（CPM）的存在，不能真实反映胎儿情况。当绒毛染色体嵌合现象发生时，应首先鉴别胎儿真性嵌合的可能性。如果在胚胎时期，细胞融合或分裂错误形成嵌合体，一般是真性嵌合体［9］。所以，准确分析判断绒毛染色体嵌合体的真假性，排除CPM的可能，对胎儿及妊娠结局的影响是非常重要的。

在孕早期绒毛活检中，CPM的发生率大约在1%～2%［10］。当发生CPM时，绒毛核型与胎儿核型结果可能出现不一致，出现绒毛嵌合现象。目前，CPM根据发生机制，可分为减数分裂型以及有丝分裂型：减数分裂型指受精卵染色体异常，在之后的分裂中，由于“错误”导致囊胚内细胞团中形成胚胎的细胞丢失异常染色体，而其余异常细胞被“驱赶”至滋养细胞层，这个过程被称为“胎儿自救”（fetal rescue）；有丝分裂型指受精卵染色体正常，异常分裂发生在胎盘细胞的前体中［11］。对于绒毛染色体发现异常核型嵌合现象时，不能盲目认定胎儿染色体存在异常，需进一步复查羊水，但即使后续羊水诊断核型结果正常，胎儿仍可能存在低水平的嵌合，并且有1／3的机会是单亲二体（uniparental disomy，UPD），对于某些可能存在印记基因的染色体，例如5、6、7、9、11、14、15、16号染色体，诊断CPM的同时还要除外UPD的存在［5］。

本病例绒毛核型与CMA结果均提示13号染色体存在异常。由于CMA的结果提示10号染色体存在嵌合重复，且重复片段断裂位点位于10q22，结合第三种异常核型，与10号染色体带纹进行比对，我们认定第三种异常核型中的未知13号染色体为一条衍生染色体，其未知附加片段来源为10号染色体的部分三体，同时伴随13号q22位置至末端的部分单体，其核型描述修正为：46，XX，der（13）t（10；13）（q22；q22）。CMA提示10号染色体嵌合重复的比例为23%，而13号染色体嵌合缺失的比例为40%，除了10号与13号染色体易位重排的衍生染色体外，还存在13号q22至末端缺失的情况，即第一种异常核型46，XX，del（13）（q22）。由于核型分析与CMA技术均存在局限性，不能排除绒毛CPM的存在，同时CMA技术对低比例的嵌合不能准确检出，所以第二种异常核型仍不能确认其来源及异常类型，需进一步复查羊水。经检测，羊水染色体核型分析以及CMA结果均提示胎儿为纯合状态的13号染色体q31至末端的缺失，“13p缺失综合征”主要临床表现为严重的智力障碍、特殊面容、中枢神经系统异常、肌张力低下等，孕妇及家属选择终止妊娠。

该病例绒毛与羊水检测出现了不同的结果，经分析发现，绒毛核型与绒毛CMA结果基本一致，羊水核型与羊水CMA结果一致，从而排除由于细胞体外培养、收获等操作造成的假性嵌合现象，可以确定该病例CPM的存在，推测13号染色体的畸变细胞异常分裂可能发生在减数分裂期，由于胎儿复杂的自救过程，导致胎盘存在三种不同形式的异常核型的嵌合，而胎儿由一种异常核型发育而来。遗憾的是本病例外院引产，未能留取胎盘组织进一步印证。

综上所述，绒毛核型分析的嵌合现象仍然是产前诊断和咨询中的难点。虽然CPM的发生率较低，当绒毛核型分析发现嵌合体时仍应充分考虑CPM的可能性，复查羊水或脐带血进一步确诊。临床上应重视CPM的存在，加强对CPM的遗传咨询。对于存在CPM且胎儿核型正常的妊娠，孕期应加强对胎儿生长发育的监测，分娩时留取胎盘多点取材，分别检测染色体核型进一步印证。