响应面法优化提取奶牛全混合日粮中总黄酮方法的研究

熊安然 潘予琮 余诗强 蒋林树* 熊本海

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

全混合日粮(TMR)是一种整合了粗料、精料、维生素等基本营养物质，能够满足奶牛生产需要的现代化饲喂技术。然而，动物饲粮既要满足基本营养物质需要，还需要起到一定的生理调节和防御的作用[1]。饲粮中的黄酮、多酚等微量营养活性物质具有的激活动物自身免疫机能、提高体内抗氧化活性和饲料报酬等功能，成为后抗生素时代实现畜禽健康养殖的重要技术策略。占今舜[2]研究指出，添加苜蓿黄酮可提高奶牛采食量，促进营养物质的消化和乳糖合成；同时还可以提高奶牛的抗氧化能力及免疫能力。在饲粮中添加30 mg/kg大豆异黄酮可以提升奶牛的乳蛋白含量，改善乳品质[3]。因此，营养活性物质很有可能作为TMR中保障奶牛健康所需的关键因素，用以区别TMR的营养价值。

卢德勋[4-5]创立的系统动物营养学理论和技术体系，首次将饲粮营养活性物质主效因子测定和分析列入饲粮优化设计，然而当前在制定奶牛TMR配方时往往忽略了TMR中营养活性物质的作用效果，关于饲粮中微量黄酮是否会对奶牛的免疫、健康有促进作用也尚未有文献报道，其中最主要的原因就是饲粮中黄酮类营养活性物质种类繁多，结构复杂，主效因子不明确，无法定量，从而制约了其在畜牧业中的广泛应用。因此，对饲粮中营养活性物质的含量进行定性定量分析势在必行。本研究选用了水浴和超声2种常见提取黄酮的方法，运用响应面分析法(RSM)[6]优化奶牛TMR中总黄酮的最佳提取条件，为进一步研究其成分结构、生物活性、作用机制提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采自首农集团北京奶牛中心良种场单产12 t以上的泌乳高产奶牛TMR，其组成及营养水平见表1；芦丁标准品(≥98%)；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝(AR，99.0%)、无水乙醇为分析纯。其余试剂均为色谱级。

表1 TMR组成及营养水平(干物质基础)

1.2 仪器与设备

KQ500DE数控超声波清洗器(功率500 W)；Multiskan FC型酶标仪；HH-8电热恒温水浴锅；MD4100D实验室双级反渗透去离子水系统。

1.3 总黄酮的提取

称取风干研磨后1.0 g奶牛TMR粉于锥形瓶中，在一定的条件下进行总黄酮的水浴提取或超声提取，然后将得到的提取液抽滤，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶，备用。

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

配制一系列不同浓度梯度的芦丁标准溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[7]，用酶标仪在510 nm的波长处测定吸光度，以芦丁浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 奶牛TMR中的总黄酮的提取

参照秦晶晶等[8]对柿叶总黄酮提取工艺优化的方法，以乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取时间(40、60、80、100、120、140 min)、提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)为影响因素，研究各因素对水浴醇提及超声提取奶牛TMR中总黄酮提取量的影响。

1.3.3 奶牛TMR总黄酮提取量的测定

准确量取样品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照1.3.1中所述方法进行操作，按下式计算黄酮提取量：

式中：W表示黄酮提取量(mg/g)；c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度(mg/mL)；D表示溶液稀释倍数；M表示样品取样量(g)。

1.4 响应面试验设计与统计分析

在单因素试验结果基础上，按照Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验。采用Excel 2007进行试验数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

由图1可知，对标准曲线进行拟合，得到芦丁浓度(x)与吸光度(y)的关系的回归方程：y=6.275 8x+0.038 7(R2=0.999 5)，线性关系极显著，表明芦丁溶液浓度在0～0.02 mg/mL,与吸光度线性关系良好。

2.2 水浴提取TMR中总黄酮的条件优化

2.2.1 不同提取条件下奶牛TMR中总黄酮的提取量

由图2可知，奶牛TMR总黄酮提取量会受到乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间的影响，呈现先增后减的变化。通过单因素分析，最终确定最佳水浴醇提奶牛TMR总黄酮的条件为：乙醇浓度为80%，料液比为1∶30，提取温度为80 ℃，提取时间为80 min。这种条件下得到的总黄酮提取量最高，为9.15 mg/g。

图1 芦丁的标准曲线

2.2.2 响应面试验结果

以奶牛TMR中总黄酮提取量为响应值，选取乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)、提取时间(D)4因素3水平进行试验设计，因素水平编码见表2。采用响应面法优化奶牛TMR黄酮提取工艺，结果见表3，方差分析见表4。

对表3中奶牛TMR总黄酮提取量(Y)及4个影响因素进行二次回归模型拟合，得到多元回归模型：Y=9.22+0.66A-0.17B-0.15C+0.37D+0.20AB-0.19AC+0.087AD-0.62BC+0.074BD-0.27CD-1.44A2-0.82B2-0.68C2-0.57D2。方差分析结果见表4 。

图2 不同提取条件下水浴萃取奶牛TMR中的总黄酮提取量

表2 因素水平编码

表3 响应面分析方案及试验结果

表4 响应面分析法方差分析

续表4方差来源Variance source平方和Sum of squares自由度Variance均方Mean squareF值F-valueP值P-valueAC0.1510.150.670.425 2AD0.0310.030.140.715 8BC1.5611.567.090.018 6∗BD0.0210.020.100.758 2CD0.2810.281.290.275 1A213.37113.3760.92<0.000 1∗∗∗B24.4014.4020.070.000 5∗∗C22.9612.9613.480.002 5∗∗D22.1312.139.720.007 6∗∗残差 Residual3.07140.22失拟项 Lack of fit2.42100.241.500.371 2纯误差 Pure error0.6540.16总和 Sum29.0728

由表4可知，失拟项P>0.05，差异不显著，说明没有失拟因素；结合模型P≤0.0001，差异极其显著，可以看出模型拟合效果很好。根据F值可知，4个因素对TMR中总黄酮提取量的影响大小依次为：乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。

乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间交互作用对奶牛TMR总黄酮提取量影响的等高线图与响应面3D图见图3。

根据图3进行响应面分析，得到最优提取条件为：乙醇浓度82.6%、提取温度80.37 ℃、提取时间75.11 min、料液比1∶34.05，此条件下奶牛TMR黄酮提取量预测值为9.396 3 mg/g。

2.3 超声提取TMR中总黄酮的条件优化

2.3.1 不同提取条件下奶牛TMR中总黄酮的提取量

通过单因素分析，最终确定乙醇浓度为90%，料液比为1∶40，当提取时间为40 min时奶牛TMR总黄酮提取量最高，为10.97 mg/g(图4)。

2.3.2 响应面试验结果

总黄酮提取量为响应值，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)3因素3水平进行试验

设计，因素水平编码见表5。采用响应面法优化奶牛TMR黄酮提取工艺，结果见表6，方差分析见表7。

对表6中奶牛TMR总黄酮提取量及4个影响因素进行二次回归模型拟合，得到多元回归模型：Y=11.39+0.21A+0.71B-0.017C-0.17AB-0.47AC-0.87BC-1.97A2-0.46B2-0.76C2。方差分析结果见表7。

由表7可知，失拟项P>0.05，差异不显著，说明没有失拟因素；结合模型P≤0.05，差异显著，可以看出模型拟合效果较好。根据F值可知，3个因素对TMR中总黄酮提取量的影响大小依次为：料液比>乙醇浓度>提取时间。

乙醇浓度、料液比、提取时间交互作用对奶牛TMR总黄酮提取量影响的等高线图与响应面3D图见图5。

由图5可知，响应面优化的最优提取条件为：乙醇浓度为90.34%、料液比为1∶49.84、提取时间为37.45 min，此条件下奶牛TMR黄酮提取量预测值为11.898 mg/g。

图3 奶牛TMR总黄酮水浴萃取响应面分析等高线(A、B、C、D、E、F)及响应面(a、b、c、d、e、f)

3 讨 论

黄酮是植物内生真菌产生的具有多种生物活性的次生代谢产物[9]，其化学成分、生物活性和含量会受到提取技术的强烈影响[10]。奶牛饲粮中的常规饲料，如苜蓿、燕麦常采用超声辅助提取法[11-14]、复合酶解协同乙醇法[15]、微波提取法[11,16]、索氏提取法[17]、浸提法[18]对其中的总黄酮进行提取；而豆粕中的黄酮成分主要是大豆异黄酮，可采用超声提取法[19]、加热回流法[20]、微波提取法[21]、磁力搅拌法[22]等进行提取。采用不同的方法提取植物中的黄酮类营养活性物质，均会受到提取溶剂浓度、料液比、提取温度和提取时间等多方面的影响。

图4 不同条件下超声提取奶牛TMR中的总黄酮含量

表5 因素水平编码

表6 响应面分析方案及试验结果

续表6编号No.乙醇浓度 Ethanol concentration/%(A)料液比 Material-liquid ratio (B)超声时间 Extraction time/min(C)总黄酮提取量 Extraction amount of total flavonoids/(mg/g)10801∶30407.772 511901∶404011.209 212801∶50409.884 9131001∶40359.752 1141001∶50409.818 515901∶503511.279 016901∶304510.811 017801∶40358.223 6

表7 响应面分析法方差分析

外源添加植物黄酮对奶牛的生产性能、免疫等各方面具有积极的促进作用。王明等[23-25]将不同浓度的大豆异黄酮与淋巴细胞共育培养发现，添加低剂量(0.25～5.00 μg/mL)的大豆异黄酮能够提高奶牛的免疫能力。李义等[27]和栗明月等[28-29]在竹叶黄酮对奶牛代谢、免疫及抗氧化方面的研究中发现，竹叶黄酮提高了热应激奶牛的抗氧化能力。然而，除了黄酮类饲料添加剂，奶牛常规饲粮中的黄酮类营养活性物质也被证明具有抗菌、抗氧化、提高动物机体免疫机能等作用。王家皓等[15]对南苜蓿叶总黄酮的抑菌效果和抗氧化能力进行研究，发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，并且对羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均表现出一定的清除能力。同样，许英一等[14]也通过试验证明了苜蓿叶总黄酮在一定的质量浓度范围具有较明显的抗氧化活性，并随着质量浓度的增加而增强。而王双慧等[13]采用滤纸片法及牛津杯法探究燕麦黄酮的抑菌效果，数据显示燕麦黄酮对大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、产酯酵母以及黑曲霉4种供试菌均有抑制作用，作用大小顺序为大肠埃希氏菌>枯草芽孢杆菌>产酯酵母>黑曲霉，并且其抑制作用随其浓度增大而增强。并且苜蓿黄酮还能够上调奶牛乳体细胞中免疫和抗氧化相关基因的表达[30]。

图5 超声提取奶牛TMR总黄酮响应面分析等高线(A、B、C)及响应面(a、b、c)

根据本试验研究结果，通过超声提取奶牛TMR中的总黄酮最大提取量达到了干物质含量的1.13%(前期测出该饲粮干物质含量为97.4%)，比钙、磷含量总和还要略高，因此饲粮中的微量活性物质很有可能具有潜在的重要作用。下一步研究可将提取工艺与HPLC等色谱技术结合，实现对饲粮中黄酮类物质的定性定量分析，从而探究不同提取方法或提取条件对奶牛TMR中总黄酮成分和含量的影响。对饲粮中的营养活性物质提取工艺进行优化，是研究这些微量成分的基础，对于探究其生物学价值、优化饲粮配方将具有重要意义。

4 结 论

通过对响应值结果进行分析，得到奶牛TMR中总黄酮最佳提取工艺为：在乙醇浓度为90%，提取时间为40 min，料液比为1∶40的条件下，通过超声提取到的总黄酮最大提取量为10.97 mg/g，该提取工艺可为奶牛TMR中总黄酮的进一步研究提供参考。