黄冈大别山一株野生灵芝的鉴定与驯化栽培*

邢 炜，洪 豆，徐碧林，王 政，刘 畅，范 霞，郑永良，吕锐玲

（黄冈师范学院 生物与农业资源学院，湖北 黄冈 438000）

灵芝（Ganoderma lucidum Karst）隶属多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属 （Ganodermae）[1]。灵芝是我国传统名贵中药，素有“仙草”的美誉。具有免疫调节[2]、抗氧化与延缓衰老[3]、抗糖尿病[4]、延长睡眠时间[5]、神经保护[6]、保护酒精诱导的肝损伤[7]，以及治疗癌症[8]等诸多作用。近年来随着“健康中国”上升为国家战略，我国大健康产业蓬勃发展。灵芝作为大健康产业中具有悠久文化历史的药用真菌，其相关的基础研究仍然非常薄弱[9]，其分类的混乱在很大程度上阻碍了灵芝基础研究的发展。黄冈大别山世界地质公园位于大别山南麓，是中国中央山系地质、地理、生态、气候分界线的重要组成部分。也是中国重要的生物基因库，是生物多样性、丰富性、珍稀性和典型性最具代表的区域之一[10]。

通过对黄冈大别山采集野生灵芝子实体进行形态学及18S rDNA分子鉴定，经驯化后进行小面积制种。在加强野生灵芝资源研究和保护的基础上，对野生灵芝资源进行驯化和种质资源的开发，培育适合当地气候的灵芝品种，为灵芝的基础研究和生产推广提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1．1．1 供试菌株

从黄冈大别山国家地质公园内蕲春县株林镇姑娘山 （东经 115°29′825″，北纬 30°19′521″，海拔52．202 m）采集到野生灵芝子实体，经组织分离获得菌株HZ1。对照菌株灵芝G10和韩芝购买于华中农业大学菌种中心。

1．1．2 培养基

PDA培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，加水至1 L。土豆煮沸过滤再加入葡萄糖、琼脂定容至1 L。培养基121℃灭菌30 min，用于原种分离及活化菌株。

PDB培养基：PDA固体培养基不加入琼脂。主要用于收集菌丝。

原种、栽培种配方为A：栎木屑80%、麦麸13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；B：桑木屑80%、麦麸13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；C：栎木屑58%、棉籽壳32%、麸皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、过磷酸钙0．5%；D：桑木屑58%、棉籽壳32%、麸皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、过磷酸钙0．5%。水适量（拌好的料中含水量约为60%），pH 5～6，原种培养料用650 mL菌种瓶装料灭菌，栽培种培养料用聚丙烯塑料袋（33 cm×17 cm×0．005 cm）装料灭菌。上述培养料均需121℃，灭菌2 h。

1.2 试剂与仪器

真菌基因组DNA快速抽提试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；熊果酸标准品，中国药检所；α-淀粉酶（BR级），上海源叶生物科技有限公司；高氯酸、冰醋酸、香草醛、三氯甲烷、苯酚、硼酸铵均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

752C可见紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司；DHZ-C智能恒温摇床，太仓实验设备厂；RE-52A旋转蒸发仪、SHZ-95循环水式多用真空泵，巩义英峪予华仪器厂。

1.3 试验方法

1．3．1 形态学鉴定

根据参考文献[11-12]对野生灵芝子实体形态特征进行鉴定。

1．3．2 菌株分离及保存

采用组织分离法，选取幼嫩未散粉野生灵芝子实体，将菌盖与菌柄部分用手术刀切成0．5 cm3小块，经75%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍后，接种于直径90 mm PDA平板上（25℃，黑暗，3 d），挑取子实体小块周围萌发的菌丝，获得纯培养菌株HZ1。将菌株HZ1接种于试管斜面上，待斜面长满后置于4℃冰箱保存。

1．3．3 菌株HZ1的18S rDNA分子鉴定

采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取DNA，提取的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，后采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物交由武汉华大基因科技有限公司进行测序，所测得18S rDNA序列与GenBank数据库进行Blast比对，采用软件MEGA 7．0对所测18S rDNA序列进行比对、Neighbor Joining法构建系统发育树。

1．3．4 灵芝菌株HZ1原种培养料的筛选

采用常规制备食用菌栽培种的方法[13]，木屑进行粉碎处理，木屑、棉籽壳、玉米粉和麸皮拌料前提前预湿3 h。已灭菌原种栽培料冷却至约30℃进行无菌接种，室温培养，培养期间及时检查污染状况和记录生长情况。培养料配方A、配方B、配方C和配方D各接种30瓶。

1．3．5 灵芝菌株HZ1有效活性成分的测定

将PDA培养基上活化好的菌株（28℃，5 d）沿菌落边缘用直径6mm的打孔器打取10个菌饼接入装有100 mL PDB液体培养基的250 mL的摇瓶中，28℃，100 r·min-1摇床培养7 d，将液体菌丝在无菌条件下匀浆20 s，取4mL菌丝碎片转接入新的PDB液体培养基，28℃，100 r·min-1摇床培养7 d，用漏斗和滤纸过滤菌丝，烘干至恒重后进行有效活性成分的提取和测定。

1）菌丝体胞内多糖提取

菌丝体胞内多糖提取采取水提法[14]进行。取烘干磨碎的灵芝菌丝体1．0 g，加30倍体积的蒸馏水，于90℃下浸提1．5 h，以转速10 000 r·min-1离心20 min，取上清液Ⅰ，沉淀加30倍体积的蒸馏水再次浸提 1．5 h，10 000 r·min-1离心 20 min，取上清液Ⅱ，将沉淀烘干；上清液Ⅰ和上清液Ⅱ合并，加入2 mg的α-淀粉酶 60℃酶解1 h，加水定容至100mL，用吸管准确吸取10mL，加入40mL无水乙醇混匀，4℃醇沉12 h，以转速5 000 r·min-1离心5min，沉淀用80%乙醇润洗3次，60℃烘干得多糖粗样品。

2）胞外多糖分离和提取

将菌丝PDB液体培养后过滤所得发酵液100 mL中加入 2 mgα-淀粉酶 60℃酶解1 h）用同样方法[14]测定胞外多糖含量。

3）灵芝菌丝体蛋白质含量测定

灵芝菌丝体蛋白质含量测定参照参考文献[15]。

4）灵芝菌丝体总三萜含量的测定

灵芝菌丝体总三萜含量的测定参照参考文献[16]。

1．3．6 灵芝菌株HZ1农艺性状的测定

根据1．3．4的栽培配方筛选结果，选择最适合灵芝菌丝生长的培养料栽培配方装袋50袋，灭菌接种后置于室温培养。7 d后测定菌丝生长速度，待子实体成熟后开始测量不同品种灵芝菌盖的直径、颜色，菌柄的长度、直径、颜色等性状。计算不同品种的鲜品产量。

2 结果与分析

2.1 野生灵芝的形态学鉴定

研究从黄冈大别山国家地质公园蕲春株林镇姑娘山采集的野生灵芝子实体的生境及其形态特征见图1。

图1 野生灵芝生长环境及子实体Fig．1 Fruitbodies and growing environmentof awild Ganoderma lingzhi

由图1可知，其地面植被为板栗树、栎木等阔叶落叶树种及灌木丛、蕨类等，子实体生长在落叶栎木伐桩上。灵芝子实体近圆形，菌盖肥大，轮纹明显，直径 5．3 cm～15．6 cm，厚 1．2 cm～1．8 cm；菌柄红褐色，粗壮有光泽，侧生，长度5 cm～15 cm，直径1．2 cm～2．8 cm，幼芝菌盖呈扇形，边缘白色厚实，菌肉白色。根据形态初步鉴定其为多孔菌科灵芝属真菌。

2.2 野生灵芝的分离

野生灵芝经分离后菌落特征见图2。

图2 菌株HZ1菌落形态Fig．2 Colony morphology of strain HZ1

由图2可知，经分离获得的野生灵芝菌株HZ1在PDA培养基中菌落圆形，偶尔会出现羽毛状，菌丝白色，生长到后期菌落中心部位菌丝微发黄，分离获得的菌株用试管斜面保存于4℃冰箱。

2.3 菌株HZ1 18S rDNA分子鉴定

经PCR扩增和凝胶电泳检测，获得18S rDNA序列片段616 bp，测序结果在GenBank中进行Blast比对，构建的分子系统发育树见图3。

图3 灵芝ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogentic tree constructed by Ganodermaspp.based on ITS sequences

由图3结果表明，菌株HZ1与灵芝属Ganoderma lingzhi物种聚于系统发育树的同一支，自展支持率100%。结合形态学鉴定结果，推定菌株HZ1为Ganoderma lingzhi。

2.4 菌株HZ1原种最适培养料配方的筛选

不同原种培养基对菌丝生长发育的影响结果见表1。

表1 不同原种培养基对菌丝生长发育的影响Tab.1 Mycelial growth and development on different mother spawn substrate

从表1可知，菌株HZ1菌丝在原种瓶中萌发和封口时间最早的是配方A和配方B，分别为2 d和5 d；满瓶时间最早是配方B，其他时间顺序依次为配方A（42 d）、配方C（45 d）和配方D（48 d）；配方A菌丝生长浓密、洁白、粗壮，菌丝密度高，生长势良好。配方B的菌丝满瓶时间最短，且极少有气生菌丝，生长势强，菌丝白色，但菌丝比配方A和配方C稀疏。配方C菌丝浓密、洁白、粗壮，菌丝密度高，生长势最强。配方D菌丝生长稀疏、发黄，菌丝密度稀薄、不均匀，生长势较配方A、配方B和配方C差。配方A和配方B有菌皮，配方C和配方D无菌皮。综合以上特征，菌丝生长最好的是配方C。

2.5 菌株HZ1活性成分含量测定

不同菌株灵芝活性成分含量见表2。

表2 不同灵芝活性成分含量比较Tab.2 Comparison of the active components of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表2可知，菌株HZ1多糖含量0.703mg·mL-1，比对照菌株灵芝G10和韩芝含量高（P<0.01）；菌株灵芝G10蛋白质含量最高（0.085 mg·mL-1），其次为菌株韩芝（0.072 mg·mL-1），菌株HZ1的蛋白质含量达到0.069mg·mL-1，与对照菌株韩芝蛋白质含量差异不显著。菌株HZ1的总三萜含量0.786mg·mL-1，比对照菌株灵芝G10含量高（P<0.01）。但综合灵芝多糖、蛋白质和总三萜的总含量，菌株HZ1的总有效活性成分含量高于对照菌株灵芝G10和韩芝。

2.6 菌株HZ1与本地栽培品种农艺性状的对比试验

不同灵芝菌株栽培情况统计见表3。

表3 不同灵芝菌株农艺性状比较Tab.3 Comparison of the agronomic traits of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表3可以看出，菌株HZ1菌丝平均生长速度比对照菌株灵芝G10和韩芝生长速度快（P<0.01），较适宜黄冈本地的气候条件；菌株HZ1的菌盖直径可达20 mm，幼菇颜色淡黄；菌株HZ1的菌柄长度为40 mm，菌柄直径约17 mm，颜色为红褐色，每袋可产灵芝鲜菇298 g，比对照菌株灵芝G10和韩芝产量高（P<0.01）。因此，菌株HZ1综合农艺性状良好，具有一定的潜在的商业推广价值。

3 讨论与结论

灵芝物种在我国分布广泛。吴国华等[17]从浙江龙泉森林中获得了8株野生灵芝菌株，对具有生长优势的菌株LQ06通过形态学和ITS序列分析，确定为灵芝属灵芝（Ganoderma lingzhi），并对菌株LQ06进行林下椴木栽培，发现菌株LQ06栽培表现优良。金鑫等[18]分别对采集于海南岛的3株野生灵芝进行形态和分子鉴定，并对子实体多糖的单糖组分和抗氧化活性进行了分析，3株灵芝分别为紫芝（G.sinense）、南方灵芝（G.australe）、无柄紫灵芝（G.mastoporum）；3株灵芝多糖的单糖组成和摩尔比存在一定的差异。张焱珍等[19]从云南临沧的野生灵芝子实体中分离纯化获得纯培养物YAASM4672，结合形态学与ITS序列分析鉴定为灵芝（G.lingzhi），并设计了9种栽培种培养基，测定其栽培特性，结果表明该菌在2号栽培种配方（78%玉米芯、18%米糠、2%高粱粉、1%石膏粉、1%白砂糖）中菌丝生长和子实体农艺性状（覆土组优于露地组）表现最好。赵丽丽等[20]从南平市顺昌县分离获得一株野生灵芝，经生物学特性比较和ITS测序后鉴定为弯柄灵芝（G.flexipes）。解凡等[21]对采自福建的3株野生灵芝进行鉴定，结果为重伞灵芝（G.multipileum）。

灵芝作为一种药用真菌，活性成分一直备受关注。李亚晗等[22]报道，灵芝多糖的抗癌作用主要通过免疫调节、抗增殖、促凋亡、抗转移和抗血管生成。黄晗等[23]报道，灵芝多糖能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，从而减轻脓毒症大鼠炎症反应并保护肺功能。亓小妮等[24]报道，灵芝三萜具有抗肿瘤、保肝护肝和增强免疫等生理功能，目前已经成为评价灵芝产品质量的重要指标之一。研究从大别山上分离得到野生灵芝1株，经室内驯化研究发现，活性物质灵芝多糖、蛋白质和总三萜的总含量比对照高，田间的农艺性状表现也良好，可为灵芝商品化推广提供菌种资源。