酶促反应芯片研究碱性磷酸酶的酶促反应

查春旺 吴剑 王成飞

摘 要：本文采用具有自主知识产权的酶促反应教学微芯片为基础结合新型层析装置，对碱性磷酸酶的酶促反应及其产物进行了初步摸索。通过该芯片可以较为方便的摸索相关反应的不同反应条件，方便进行最佳反应速度、温度等的摸索，结合新型色谱层析装置可以分离和分析反应的产物。相关设备便携性好，可用于相关知识点的教育教学，同时考虑到酶促反应在人体中的重要地位，本装置在生物制药、生物工程、医药卫生等领域也有广泛的应用前景。

关键词：酶促反应教学微芯片;碱性磷酸酶;色谱层析

碱性磷酸酶酶促反应实验是生化实验中经典的反应，但是该实验操作过程较为复杂，使得相关实验只能在实验室进行。我们将微流控芯片这一分析化学的热点技术[1-3]，引入教学领域发展了教学微芯片，并进一步发展了酶促反应教学微芯片[4]该芯片可以一次性生成多个不同条件，结合我们发展的新型色谱层析装置[5]，对上述反应的产物进行分析，可以发现这两个装置的结合可以很好的对相关反应进行研究，相关设备便携性好，可用于相关知识点的教育教学，同时考虑到酶促反应在人体中的重要地位，本装置在生物制药、生物工程、医药卫生等领域也有广泛的应用前景。现报道如下：

1  实验部分

1.1  试剂、用品和仪器

陶瓷加热片、PID温度控制装置、Pt100感温探头、液冷风扇、水晶胶、食品级硅橡胶、D1500型自动光刻机、配套光刻板（聊城科天激光设备有限公司）、小青龙牌食品级硅胶（A、B胶1：1混合）、小青龙牌水晶胶（快干型A、B胶2：1混合）、收音机伸缩天线，品牌： HW（初始长度127mm拉伸320mm天线）（均购自淘宝）。薄层层析硅胶，天津光复精细化工研究所。

1.2 酶促反应芯片制备

采用本课题组的专利技术制备[4]，过程包括coredraw软件设计芯片结构，光刻机光刻制备相关的管道模板，按A：B=1：1比例混合食品硅膠A、B胶获得前聚体浇筑到上述

阳模上待其固化，剥离获得食品硅胶阳模，按A：B=3：1混合水晶胶A、B胶获得前聚体浇筑到上述阳模表面待其固化，剥离得到水晶胶管道芯片，制备上盖片，按需要封合芯片即可。

图1为芯片实物，从中间的两个进水口1、2注射后两端的出口处即可不同浓度的溶液，在不同的出口处分别用控温元件进行温度控制，即可形成不同条件的反应池。

1.3 色谱层析装置

该装置按照文献[5]制备，同样使用食品级硅胶和水晶胶制备，使用coreldraw软件设计的结构是具有凸棱的顶盖模型和类似手的结构的底座模型。将四个伸缩天线通过热溶胶分别固定、安装在顶盖和底座边缘，连接二者，且保证顶盖的贯通槽与底座的凹槽相对应，完成器件制作。

1.4 碱性磷酸酶酶促反应条件摸索

在实验时将一定浓度的碱性磷酸酶注射入两端的在反应池中，底物磷酸苯二钠溶液和水溶液分别从芯片的进样口1、2注入，在反应池中形成不同的浓度，通过芯片两端反应池的控温元件控制反应温度，可以摸索不同温度不同底物浓度对该反应的影响，可在反应池中加入该反应的抑制剂Na2HPO4观察抑制剂对反应的影响。

所有反应池均在15分钟后加入0.5mol/L NaOH 0.1 ml以中止反应。然后在各反应池中加入0.3%的4-氨基安替比林0.1 ml及0.5%铁氰化钾0.2 ml，充分混匀，放置10分钟以将生成的苯酚反应成红色的醌类。

用毛细管蘸取上述各池的反应物，点在薄层板上，将薄层板放入上述制备的薄层层析装置中，按需要一个装置可同时进行5-10组的薄层层析，通过比较层析板上红色斑点（苯醌）的颜色深浅可以了解反应进行的程度。

2 结果与讨论

不同温度下控制相关反应，在37oC，生成的苯醌斑点颜色最深，该反应的最适合温度为37oC。如通过ImageJ软件对斑点进行分析，可得底物浓度和酶促反应的关系，结果符合米氏方程。在反应池体系中加入的Na2HPO4抑制剂可以明显的降低红色斑点的颜色。

3  结论

本文综合应用具有自主知识产权的酶促反应微芯片和新型色谱层析装置，进行了碱性磷酸酶酶促反应条件的摸索，该联合装置具有一定的便携性，反应结果比较明显，由于采用酶促反应芯片节约了实验试液的配制时间，也很方便控制不同反应池的温度和抑制剂等多种条件，因此可以快速的对相关反应进行研究，其可以应用在课堂教学中，同时碱性磷酸酶广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠组织是非常重要的酶类，对其进行快速检测显然具有重要的意义，因此本装置未来在生物制药、生物工程、医药卫生等领域也有广泛的应用前景。

参考文献：

[1]王国阳，白志晨，王佳慧，苏波，张存林.光谱学与光谱分析，2021，41（06）：1678-1682.

[2]夏韬然，邹伟，刘晶.生物工程学报：1-10[2021-06-16].https：//doi.org/10.13345/j.cjb.210025.

[3]李玮玮，李雨轩，林金明.分析测试学报，2021，40（06）：822-827.

[4]查春旺，吴剑，朱丹，海潇雅，刘慧敏，张思雨，程永婷. 一种酶促反应教学微芯片[P]. 安徽省：CN211586660U，2020-09-29.

[5]吴剑，王成飞，孟婵婵，唐玲，王文东，马雨婷，蒋欢. 一种色谱层析教具及其制备方法[P]. 安徽省：CN109490463A，2019-03-19.

通讯作者：吴剑。

基金项目：安徽省教育厅教学研究重点项目（2019jyxm0552），安徽省教育厅高校自然科学研究重点项目（KJ20180795），安徽中医药高等专科学校校级项目（ZRKXY201910）。