基于网络药理学和分子对接研究灯盏细辛抗衰老的作用机制

普元柱，苏 灿，朱屹韬，肖清青，张霆峰，李恒瑶，周荣毅

1云南中医药大学中药学院，昆明 650500；2云南省科学技术院，昆明 650051

人口老龄化是当今中国和世界所面临的一道难题。人口老龄化不仅带来适龄劳动力减少、国家和家庭的养老负担增加等问题，还带来一系列健康问题。研究证实，衰老是心脑血管疾病、糖尿病、癌症、神经退行性疾病等诸多复杂疾病的危险因素[1]。虽然衰老不可阻止，但可通过热量限制、基因操作、药物干预等方式延缓衰老[1]。更重要的是，延缓衰老不仅延长机体寿命，而且明显改善机体健康状况。如，在大多数慢性疾病中，限制食物摄入量可有效降低症状严重程度；二甲双胍、雷帕霉素在多个模式生物中显示能延长寿命，流行病学研究表明人类适量服用二甲双胍、雷帕霉素可预防许多癌症的发生，降低神经退行性疾病的发病率[1]。因此，延缓衰老是降低老年相关疾病发生率的有效方法之一。

中医自古强调养生保健，不治已病治未病，中医药抗衰老受到越来越多的关注。灯盏细辛Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.是治疗心脑血管疾病等老年性疾病的常用中药，其活性成分主要是黄酮类和咖啡酰类成分。研究发现黄酮类成分灯盏花素可对抗D-半乳糖诱导的衰老，改善小鼠记忆障碍及肝、肾异常变化，但其作用机制仍不清楚[2,3]。而灯盏细辛中的咖啡酰类成分是否具有抗衰老作用，目前仍未见报道。网络药理学是一种基于受体理论和生物网络技术，整体阐述药物作用及其作用机制的研究方法。中药以口服为主，只有入血成分才可能是中药治病和保健的有效成分。为探析灯盏细辛抗衰老作用机制，为后续实验研究提供思路，本研究检索灯盏细辛口服入血成分，应用网络药理学方法整体预测入血成分抗衰老靶点、分析靶点生物功能及作用通路，并以分子对接方法对入血成分与关键靶点的结合作用加以验证。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

灯盏细辛入血成分及其结构式检索数据库：CNKI、万方、PubMed、Web of Science， PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；靶点预测/检索数据库：TCMSP(中药系统药理学数据库与分析平台，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、STITCH(http://stitch-beta.embl.de/)；蛋白质数据库：UniProt(https://www.uniprot.org/)、PDB(http://www.rcsb.org /)；衰老靶点数据库：HAGR(人类衰老基因组资源库，https://genomics.senescence.info/)；蛋白质相互作用分析平台：STRING(https://string-db.org/)；生物信息分析平台：DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov)及STRING；网络构建、分析软件：Cytoscape 3.7.0、Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；分子对接软件：Discovery Studio 2.5。

1.2 灯盏细辛入血成分抗衰老靶点预测

以灯盏细辛、Dengzhanxixin、Erigeronbreviscapus、口服入血、oral administration、plasma、absorbed components、药代动力学、pharmacokinetics、代谢、metabolites、化学成分中英文名称等为关键词在CNKI、万方、PubMed、Web of Science等数据库中检索灯盏细辛口服入血成分。在PubChem数据库查找入血成分的CAS号、SMILES格式文件。将各成分的SMILES分别导入STITCH和SwissTargetPrediction数据库预测各入血成分潜在作用靶点，以各成分的CAS号，在TCMSP数据库中查找相应成分的靶点。以上3个数据库得到的靶点合并去重后，即为灯盏细辛口服入血成分潜在作用靶点。从HAGR数据库查找和下载人类衰老相关基因，再从中筛选出在细胞模型中证实可影响细胞衰老和/或在动物模型中证实可影响寿命的基因作为衰老靶点。将灯盏细辛口服入血成分潜在作用靶点与衰老靶点输入Venny 2.1.0软件，交集部分即为灯盏细辛抗衰老靶点。将靶点输入Uniprot数据库，选定物种为“homo sapiens”，得到靶点的相应信息，如Uniprot ID、蛋白名。

1.3 生物功能与通路富集分析

将灯盏细辛抗衰老靶点导入DAVID数据库，Select identifier选“official gene symbol”，List type选“gene list”，物种选“homo sapiens”，阈值P< 0.05，对灯盏细辛抗衰老靶点进行gene ontology(GO)分析生物过程(biology process)。采用STRING平台对灯盏细辛抗衰老靶点进行KEGG通路富集分析，蛋白种属选“homo sapiens”，阈值P< 0.05，其余参数均默认。

1.4 靶点互作网络构建及分析

将灯盏细辛抗衰老靶点上传到STRING平台，蛋白种属选“homo sapiens”，交互作用评分阈值设置为大于0.9，其余参数均默认，得到靶点蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络数据，结果保存为TSV格式并导入Cytoscape 3.7.0软件构建PPI网络图，应用Cytoscape的“Network Analyzer”计算网络拓扑参数，以靶点在网络中的度(degree)值筛选灯盏细辛抗衰老关键靶点，度值越大，表明与该靶点有相互作用的靶点数越多，在灯盏细辛抗衰老中的作用越重要，即为灯盏细辛抗衰老关键靶点。

1.5 灯盏细辛入血成分-靶点网络构建及分析

采用Cytoscape 3.7.0构建灯盏细辛入血成分-靶点网络。应用Cytoscape的“Network Analyzer”计算网络拓扑参数，以入血成分在网络中的度(degree)值筛选灯盏细辛抗衰老的关键成分，度值越大，表明该成分作用靶点数越多，在灯盏细辛抗衰老中的作用越重要，即为灯盏细辛抗衰老关键成分。

1.6 灯盏细辛入血成分与关键靶点分子对接验证

选择灯盏细辛口服入血成分作为配体、PPI网络中度值较大的前几个靶点作为受体，应用Discovery Studio 2.5软件的LibDock模块进行分子对接。在PubChem数据库下载入血成分3D结构，在PDB数据库下载靶点的蛋白结构，然后导入Discovery Studio软件，入血成分用CHARMm力场进行能量优化，再用“Prepare Ligands”批量处理，保存作为对接配体；蛋白先删除水分子，加氢，再用“Prepare Protein”处理，保存作为对接受体。原蛋白晶体结构有配体者，以该配体位置为中心扩大一定范围(设半径9～12 Å)作为活性结合位点，原蛋白晶体结构无配体者，利用软件自带的“Find Sites from Receptor Cavities”寻找受体中可能的活性结合位点。选择Libdock对接模式，Docking Preferences参数选择“User Specified”，在Max Hits to Save参数中输入值“10”，其余参数均默认，进行分子对接。对接完成后，以原配体或相应蛋白晶体的上市药物与蛋白晶体对接打分(LibDock score)为阈值，得分高于此阈值的入血成分，即认为对该靶标具有潜在活性。为验证分子对接流程可靠性，原蛋白晶体结构有配体者，将配体抽离后，再按上述方法对接回原结合口袋，然后计算对接后配体的构象与原始晶体结构中配体构象的均方根偏差(RMSD)，当RMSD小于2.0时，证明对接方法可靠。

2 结果

2.1 灯盏细辛口服入血成分

通过文献检索和筛选，共检索到灯盏细辛口服入血成分30个，包括黄酮类成分13个，咖啡酰类成分11个，其他类成分6个(见表1)。

表1 灯盏细辛口服入血成分Table 1 Components absorbed into blood after oral administration of E.breviscapus

续表1(Continued Tab.1)

2.2 灯盏细辛抗衰老潜在作用靶点

从STITCH、SwissTargetPrediction、TCMSP数据库，分别预测、查找到灯盏细辛口服入血成分潜在作用靶点103、590、214个，合并去重后得到灯盏细辛作用靶点777个。从HAGR数据库查找到人类衰老相关基因307个，其中有131个基因在细胞模型中证实可影响细胞衰老和/或在动物模型中证实可影响寿命。将灯盏细辛777个预测靶点和131个衰老基因求交集，得到灯盏细辛抗衰老潜在作用靶点37个(见表2)。

表2 灯盏细辛抗衰老潜在靶点Table 2 Potential anti-aging targets of E.breviscapus

续表2(Cotninued Tab.2)

37个靶点中，22个靶点在细胞模型中证实可影响细胞衰老。其中，8个靶点其激活/过表达可抑制细胞衰老；14个靶点其激活/过表达可诱导细胞衰老。14个靶点在小鼠(Musmusculus)模型中证实可影响寿命，其中6个为促长寿靶点(pro-longevity targets)，其激活/过表达可延长寿命，而抑制其活性/表达则缩短寿命；8个为抗长寿靶点(anti-longevity targets)，抑制其活性/表达可延长寿命，激活其活性/表达则缩短寿命。2个靶点AKT1、SIRT1在细胞和小鼠模型中均证实可影响衰老(见图1)。

图1 37个靶点对细胞衰老(A)和小鼠寿命(B)的影响Fig.1 The effects of 37 targets on cellular senescence (A) and longevity of Mus musculus (B)

2.3 灯盏细辛抗衰老靶点生物过程与通路富集分析

将37个靶点的基因名称导入DAVID数据库和STRING平台，分别进行生物过程和通路富集分析。依据P-value < 0.05筛选出生物过程199个，通路131条，分别选取P-value最小的前20条作图(见图2)。如图所示，生物过程主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、细胞对缺氧的反应(cellular response to hypoxia)、复制性衰老(replicative senescence)、细胞衰老(cell aging)等，表明这些生物过程可能是灯盏细辛抗衰老的重要生物过程(见图2A)；通路结果显示，除涉及衰老相关通路细胞衰老(cellular senescence)、寿命调节通路(longevity regulating pathway，longevity regulating pathway-multiple species)外，其他主要涉及的是肿瘤调节通路，如肿瘤通路(pathways in cancer)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、前列腺癌(prostate cancer)、肿瘤中的微RNA(microRNAs in cancer)、乳腺癌(breast cancer)(见图2B)，说明这些通路可能是灯盏细辛抗衰老的主要信号通路。

图2 灯盏细辛抗衰老靶点的生物学过程(A)和通路(B)富集分析Fig.2 Biology process (A) and pathway (B) analysis of targets of E.breviscapus anti-aging

2.4 灯盏细辛抗衰老靶点PPI网络

依据STRING平台中的抗衰老靶点蛋白相互作用数据，采用Cytoscape软件构建得到灯盏细辛抗衰老靶点交互作用网络(见图3)，该网络包括32个节点和93条边。32个节点为灯盏细辛抗衰老靶点，其余5个靶点ADCY5、KCNA3、EEF1E1、TOP1、MIF，在设定的大于0.9可信度条件下，不存在交互作用。网络分析显示，在灯盏细辛抗衰老靶点的PPI网络中，TP53、AKT1、RB1、HRAS、HDAC1、SIRT1的度值分别为22、16、12、10、10、9，是度值最大的前6个节点，表明这6个节点是灯盏细辛抗衰老的关键靶点，可能在灯盏细辛抗衰老过程中发挥重要作用。

图3 灯盏细辛抗衰老靶点的蛋白相互作用网络Fig.3 The protein-protein interaction network of targets of E.breviscapus anti-aging注：节点面积大小代表靶点度值；节点间边线粗细代表靶点之间的关系值评分(combine score)，评分越高边线越粗。Note:Area of nodes represents degree value;Thickness of the edge between any two nodes represents combine score between any two targets,the higher the combine score,the thicker the edge.

2.5 灯盏细辛入血成分-靶点网络

将灯盏细辛30个入血成分及37个抗衰老靶点导入Cytoscape软件，得到灯盏细辛入血成分-抗衰老靶点网络(见图4)。该网络共包括67个节点，200条边，其中30个节点为灯盏细辛入血成分，37个节点为灯盏细辛抗衰老靶点。网络分析显示，作用衰老靶点数在10个以上的入血成分是槲皮素、芹菜素、木犀草素、黄芩素、山柰酚、柚皮素，6个成分作用的靶点数分别为26、19、15、15、11、11；作用衰老靶点数在5-9个的入血成分是野黄芩素、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、灯盏花苷I、东莨菪亭、异莨菪亭、5-CQA、绿原酸、对羟基苯甲酸、原儿茶醛，10个成分作用的靶点数分别为9、8、8、7、7、6、5、5、5、5；其余14个成分作用衰老靶点数小于5。6个靶点(IGF1R、INSR、PARP1、CDK1、PTK2、TERT、PRKCD)与10及10个以上灯盏细辛入血成分有相互作用，其余31个靶点与入血成分相互作用数小于10。该网络说明灯盏细辛抗衰老是多成分、多靶点作用的结果，相互作用多的成分和靶点可能是灯盏细辛抗衰老的关键节点。

图4 灯盏细辛入血成分-靶点网络Fig.4 Absorbed components-targets network of E.breviscapus anti-aging注：黄绿色节点代表入血成分；淡红色节点代表靶点；节点面积大小代表度值。Note:Yellow-green nodes represent the absorbed components, Light-red nodes represent targets;Area of nodes represents degree value.

2.6 灯盏细辛入血成分与关键靶点分子对接验证

采用Discovery Studio 2.5软件的LibDock模块，对30个灯盏细辛入血成分与6个关键靶点进行分子对接验证。6个靶点中，TP53(PDBID:5AB9)、AKT1(PDBID:3CQW)、HRAS(PDBID:2UZI)、SIRT1(PDBID:4ZZI)的蛋白晶体结构含有配体，将配体抽离后，再按1.6项下步骤对接回原结合口袋，计算对接后配体的构象与原始晶体结构中配体构象的RMSD值分别为1.2816(TP53)、0.6733(AKT1)、0.9361(HRAS)、0.9585(SIRT1)，均小于2.0，说明本研究对接方法可靠。以成分及对应靶点对接打分构建热图(见图5)。如图所示，所有入血成分均能与6个靶点对接。原配体与TP53、AKT1、HRAS、SIRT1对接打分分别为100.95、83.33、183.404、105.62；上市药物Romidepsin与HDAC1(PDBID:6Z2J)对接打分为64.71；RB1(PDBID:4ELJ)无原配体，也没有相应上市药物，故不做后续分析。以上述打分为阈值，所有入血成分与HRAS的对接打分均低于阈值，表明30个入血成分与该靶点的结合可能较弱；17个入血成分与TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1结合打分均高于阈值，包括黄酮类成分灯盏甲素、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、黄芩素、柚皮素、木犀草素，咖啡酰类成分4,5-DCQA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、1,3-DCQA、1,5-DCQA、4-CQA、5-CQA、绿原酸、灯盏花苷I；4个入血成分与TP53、AKT1、SIRT1结合打分均高于阈值，分别是槲皮素、野黄芩素、山柰酚、芹菜素。以上分子对接结果表明，黄酮类和咖啡酰类成分是灯盏细辛抗衰老的潜在活性成分，可能通过TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1这些靶点而发挥抗衰老作用。

图5 灯盏细辛入血成分与关键靶点对接打分热图Fig.5 Heatmap for docking score of key targets with absorbed components of E.breviscapus

打分最高的4,5-DCQA与TP53(见图6A)、野黄芩苷与AKT1(见图6B)、3,4-DCQA与HDAC1(见图6C)、3,5-DCQA与SIRT1(见图6D)的结合模式进行分析，结果显示结合模式主要是氢键、烷基-π键(Pi-Alkyl)、碳氢键。以黄酮类成分野黄芩苷与AKT1的结合为例，其结构中的羰基和羟基分别与氨基酸残基GLY159、THR160、PHE161、GLY162、LEU156形成5个氢键，黄酮母核3个环与VAL164(3个)、ALA177、MET281形成5个烷基-π键，MET227与B环形成1个硫-π键，糖基与LYS163、GLY162形成2个碳氢键。以咖啡酰类成分3,5-DCQA与SIRT1的结合为例，其结构中的羰基和羟基与氨基酸残基TYR280、HIS363、VAL412、ASN346、ARG446、ASP348形成6个氢键，咖啡酰基苯环分别与ALA262、ILE270形成2个烷基-π键、与VAL445形成π-σ键，另有阴离子π键(HIS363)、碳氢键(SER265、ILE347)形成。在结合空腔外围，PHE273、PHE413、PHE414、LYS203、ASP204在保持口袋的疏水性方面起到了重要的作用。

图6 灯盏细辛抗衰老靶蛋白-入血成分分子结合模式图Fig.6 Molecular docking pattern of target protein-absorbed components of E.breviscapus anti-aging

3 讨论

网络药理学常以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、半衰期(half-life，HL)≥4、类药性(drug like，DL)≥0.18为条件筛选研究成分。作者发现，灯盏细辛若以该条件筛选成分，其黄酮类主要活性成分野黄芩苷和咖啡酰类成分完全排除在外，这显然与目前认为这两类成分是灯盏细辛的主要活性成分的认识不符。中药以口服为主，口服后吸收入血的成分即有可能是中药的活性成分。因此，本研究按照血清药物化学的思路，将灯盏细辛中含有的且有文献报道口服可吸收入血的成分作为网络药理学研究的对象。

本研究检索到灯盏细辛口服入血成分30个，包括黄酮类成分13个，咖啡酰类成分11个，其他类成分6个，预测作用于37个衰老靶点。这37个靶点主要涉及衰老、肿瘤调节等生物过程和通路，这与“肿瘤和衰老密切相关，衰老是肿瘤的最大风险因素”的认识相一致。研究表明，随着年龄的增长，DNA损伤和突变增多，导致患癌风险升高[18]。另外，衰老引起的循环系统、内分泌系统、免疫系统改变，也可能导致癌症发生率上升[18]。PPI网络分析显示，TP53、AKT1、RB1、HRAS、HDAC1、SIRT1是灯盏细辛抗衰老的潜在关键靶点。肿瘤蛋白p53(TP53)是一种肿瘤抑制蛋白，其调控着肿瘤发生和衰老进程。过表达TP53可诱导细胞衰老，在小鼠体内异常激活p53降低了肿瘤发生率，但也导致小鼠过早的衰老。进一步研究发现，高表达且受到正常调控的p53在提高机体对肿瘤耐受性的同时，还不会导致过早衰老和寿命缩短现象的发生[19]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，抑制AKT1活性可延长寿命，如Akt1缺陷小鼠(Akt1+/-)雄性寿命延长8%，雌性寿命延长15%[20]。视网膜母细胞瘤基因1(RB1)是一个抑癌基因，在衰老调节方面，RB1主要通过抑癌基因p16途径使细胞发生衰老[21]。Harvey鼠肉瘤病毒癌基因(HRAS)是RAS致癌基因家族的成员，过表达HRAS可诱导细胞衰老，已证明RAS途径与胰岛素/胰岛素样生长因子一起影响着线虫的发育和衰老[22]。组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在发育、转录调控和细胞周期进程等过程中起着重要的作用。过表达HDAC1可诱导细胞衰老，在果蝇中突变HDAC1的同源体Rpd3延长雄性果蝇寿命33%，延长雌性果蝇寿命52%[23]。SIRT1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，其激活可延缓衰老，促进长寿。在小鼠脑部特异性过表达SIRT1延长雌性寿命16%、雄性寿命9%[24]。因此，灯盏细辛通过作用于这些靶点可起调节衰老的作用。

入血成分-靶点网络分析显示，黄酮类成分是灯盏细辛抗衰老的重要活性成分；分子对接显示，黄酮类成分与4个潜在关键靶点TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1结合打分高于阈值，进一步提示黄酮类成分是灯盏细辛抗衰老的潜在活性成分。不同的是，网络分析显示咖啡酰类成分在灯盏细辛抗衰老的作用中不是关键成分，但分子对接显示，除咖啡酸、阿魏酸外，11个咖啡酰类成分与TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1结合打分均高于阈值，整体甚至高于黄酮类成分。分析原因可能是目前对咖啡酰类成分研究的不多，靶点预测数据库中收录的与该类成分结构相似的化合物较少或已验证的有关该类成分靶点的信息较少，所以预测到的靶点数较少所致。在777个灯盏细辛预测靶点中，13个黄酮类成分平均每个成分预测到的靶点数是102，而11个咖啡酰类成分平均每个成分预测到的靶点数仅为26。通过文献研究，黄酮类和咖啡酰类成分均可能是灯盏细辛抗衰老的主要活性成分，可能通过TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1这些靶点而发挥抗衰老作用。实际上，这两类成分，有的经寿命实验证实确有抗衰老的作用，而且有的成分的抗衰老机制与本研究预测结果相一致。线虫寿命实验发现，槲皮素、黄芩素、山柰酚、绿原酸、5-CQA、4-CQA、1,3-DCQA、1,5-DCQA分别延长线虫平均寿命18.0%、45.0%、10%、20.1%、12.1%、15.2%、12.5%、8.0%[25]。其中，文献证实绿原酸通过抑制AKT1活性而延长线虫寿命[25]，这与本研究中AKT1是灯盏细辛抗衰老的关键靶点、绿原酸与AKT1有很好的结合作用的结果相一致。以上这些报道与本研究结果相互佐证，表明本研究结果具有一定的可靠性。因而，研究结果中至今没有明确的实验证实有抗衰老作用的成分，可根据预测结果设计相应实验加以验证。

综上，本研究以灯盏细辛口服吸收入血成分为研究对象，通过网络药理学方法分析了灯盏细辛抗衰老的潜在作用靶点及通路，并结合分子对接验证了这些入血成分与主要潜在作用靶点的结合能力，研究结果表明黄酮类和咖啡酰类成分是灯盏细辛抗衰老的潜在活性成分，可能通过作用于TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1这些靶点，进而调控衰老和肿瘤等相关生物过程和通路而发挥抗衰老作用，研究结果为后续实验验证提供了思路。