雷州黑鸭组氨酸解氨酶基因的遗传多态性及与产蛋性能的相关性分析

陆惠娴,苏 瑛，谢 涛，阮梦茹，AMBREEN Iqal，王一诺，高 振，刘 娟，姜 平，赵志辉 (广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江 524088)

我国是家禽养殖大国，每年家禽产品的产量居世界前列，据统计，2018年禽蛋产量和禽肉产量分别位居世界第一和第二[1]。而且我国家禽地方品种资源丰富，但地方品种的繁殖力较低下，农民投入增加，产出减少，这造成了地方品种资源流失问题。广东省粤西地区具有多种家禽地方品种，其中雷州黑鸭是主要分布在雷州半岛的地方品种，其属于蛋肉兼用型黑羽鸭，体格小，肉质鲜美，具有高产蛋率，耐粗饲、抗病力强和环境适应力强等优点，广受当地人民的喜欢，但由于缺乏系统性选育，导致动物群体遗传性能存在较大差异，生产性能受到制约，因此雷州黑鸭高产核心群体的选育工作仍需进一步的探索和开展[2-3]。有研究表明[4- 5]，使用产蛋曲线拟合的方法得出雷州黑鸭产蛋高峰期为27～41周龄，而且高峰期产蛋率在90%以上；马猛等[6]研究表明雷州黑鸭肉用和蛋用价值丰富，富含多种微量元素，尤其是人体所需的Fe元素，营养价值高。因此，对于极具生产价值和经济价值的雷州黑鸭品种的研究，为开展培育高产雷州黑鸭核心群体，提高产蛋性能提供新的方向。

组氨酸解氨酶(histidine ammonia-lyase,HAL) 也称组氨酸酶和组氨酸脱氨酶，是属于碳氮裂解酶家族的一员，催化组氨酸分解代谢的第一反应，即催化组氨酸脱氨生成尿刊酸[7]。有研究表明[8-10]，HAL基因的突变与组氨酸血症、非黑色素瘤皮肤癌的风险以及冠心病发病率有关。WANG等[11]在HAL基因研究区域共检测到15个SNP，结果表明，该基因的多态性与中国荷斯坦奶牛产奶量和乳蛋白产量显著相关。然而，HAL基因在产蛋性能方面的功能研究尚未见报道。FEIGELSON等[12]将小鼠在切除卵巢后发现其脱氨酶活性受到抑制，注射17-β雌二醇后发现脱氨酶活性恢复，组氨酸的分解反应加快，说明雌激素能加强脱氨酶活性，而雌激素是对于畜禽生产中最重要的激素之一，直接影响畜禽的生产性能，也可能暗示HAL基因可能对畜禽的生产性能有影响，对提高雷州黑鸭的产蛋量有一定的作用。

因此，本试验初步探讨HAL基因的遗传多态性与雷州黑鸭产蛋性能的相关关系，采用直接测序的方法验证HAL基因的相关分子标记，为挖掘相关遗传标记在雷州黑鸭的标记辅助选择提供依据，为进一步构建雷州黑鸭高产核心群奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物300 d雷州黑鸭93只来自于湛江市某养殖场的F4代基础群。颈静脉采血2 mL，用肝素抗凝管收集后，-20℃保存备用以提取血液基因组DNA。

1.2 主要试剂全基因组血液DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自博格林生物有限公司；Taq PCR Mix、1×TAE电泳缓冲液均购自诺维赞公司。

1.3 血液基因组DNA提取采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，步骤参照试剂盒说明书，使用NanoDropTMLite Spectrophotometer仪器检测DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.4 DNA混池构建随机选择30～40个DNA样品进行等量混合，制备成DNA混池样品。

1.5 引物设计根据Ensemble数据库提供的HAL基因组序列(编号：ENSAPLG00000003775.2)，使用Primer 5.0软件进行HAL基因的引物设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：上游引物：5′-GAATGGCACCTGAGTTAGCA-3′；下游引物：5′-CCTGTTCTGGTTCTCGGTATTTGCT-3′。

1.6 目的基因PCR扩增及验证PCR反应体系20 μL：2×Green Taq Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。反应程序：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。进行1%琼脂糖凝胶电泳验证后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2 结果

2.1 HAL基因PCR扩增产物验证PCR扩增雷州黑鸭HAL基因产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，PCR产物扩增特异性良好，无杂带，条带清晰，可直接用于测序鉴定(图1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.分别为不同个体的PCR扩增产物图1 雷州鸭HAL基因PCR扩增结果

2.2 测序结果HAL基因内含子1和2中发现了7处SNP位点，分别为I1-288 C>T、I1-373 T>G、I1-438 A>G、I2-16 C>A、I2-123 A>T、I2-141 G>A、I2-168 A>G。7个SNPs的每种基因型测序结果如图2～8所示。

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为CT、CC、TT的个体图2 HAL基因I1-288 C>T 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为TG、GG、TT的个体图3 HAL基因I1-373 T>G 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为AG、AA、GG的个体图4 HAL基因I1-438 A>G 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为CA、CC、AA的个体图5 HAL基因I2-16 C>A 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为AT、TT、AA的个体图6 HAL基因I2-123 A>T 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为GA、AA、GG的个体图7 HAL基因I2-141 G>A 3种基因型的测序图谱

Ⅰ～Ⅲ.基因型分别为AG、AA、GG的个体图8 HAL基因I2-168 A>G 3种基因型的测序图谱

表1 HAL基因7个SNPs的群体遗传特性

2.4 HAL基因SNPs与雷州黑鸭产蛋性能的相关性分析使用SPSS 22.0单因素方差分析HAL基因SNPs与雷州黑鸭产蛋性能的相关性，结果如表2所示，I1-288 C>T位点的CC型的开产体质量显著高于TT型，而CC型的300 d产蛋数则显著低于TT型(P<0.05)；在I1-373 T>G位点中TT型的300 d产蛋数相对GG型显著升高(P<0.05)；I1-438 A>G位点的AA型的开产日龄极显著低于AG型(P<0.01)；I2-16 C>A位点的AA型的开产日龄显著低于AC型(P<0.01)；同样，在 I2-123 A>T位点中TT型的开产日龄相对AT型显著降低，而TT型的300 d产蛋数则显著高于AT型(P<0.05)；I2-141 G>A位点的AA型的开产日龄显著低于GG型(P<0.05)，AG型的开产体质量则极显著高于GG型(P<0.01)，而AG型的300 d产蛋数显著低于GG型(P<0.05)；同样，在I2-168 A>G位点中GG型的开产日龄极显著低于AA型(P<0.01)，AG型的开产体质量则显著高于GG型(P<0.05)，而AG型的300 d产蛋数显著低于GG型(P<0.05)。7个SNPs均与开产蛋重无显著影响(P>0.05)。

表2 HAL基因7个SNPs与雷州鸭产蛋性能相关性分析

续表2

由以上结果可见，除I1-288 C>T和I1-373 T>G位点外，其余SNPs位点均与雷州黑鸭开产日龄显著相关，推测其余5个SNPs位点能作为雷州黑鸭开产日龄性状的分子标记位点；I1-288 C>T、I2-141 G>A和I2-168 A>G 3个位点均与雷州黑鸭开产体质量显著相关，说明这3个SNPs可能对提高开产体质量有重要指导作用；I1-288 C>T、I1-373 T>G、I2-123 A>T、I2-141 G>A和I2-168 A>G 5个位点均与雷州黑鸭300 d产蛋量显著关联，表明这5个位点可作为提高雷州黑鸭产蛋量的重要遗传标记。

2.5 HAL基因单倍型与雷州黑鸭产蛋量的关联分析使用HaploView 4.2软件对7个SNP位点进行连锁分析，如图9和表3所示，结果发现I1-438 A>G、I2-16 C>A、I2-123 A>T、I2-141 G>A这4个位点存在强连锁遗传，4个位点构成了一个结构域，共有10种不同的单倍型，其中只有7种单倍型有生物学统计意义(个体数大于3)分别为H1H1(AACCTTAA)、H1H2(AGCATAAG)、H1H3(AACCTAAG)、H1H4(AACCTTAG)、H2H2(GGAAAAGG)、H2H3(AGCAAAGG)、H3H4(AACCTAGG)。

表3 HAL基因单倍型频率

图9 HAL基因的奶牛群体SNPs位点连锁反应

使用SPSS 22.0单因素方差分析7种单倍型与雷州黑鸭产蛋性能的相关性，结果如表4所示，H1H2单倍型的开产日龄显著高于H1H1、H1H3单倍型(P<0.05)；H1H2和 H1H4单倍型的开产体质量显著高于H1H1单倍型(P<0.05)；而H1H1单倍型的300 d产蛋数显著高于H1H3单倍型(P<0.05)。其余单倍型与雷州黑鸭产蛋性能均无显著性差异(P>0.05)。

表4 HAL基因单倍型与雷州鸭产蛋性能相关性分析

3 讨论

3.1 雷州黑鸭HAL基因的遗传多态性近年来有越来越多的研究人员关注基因多态性对雷州黑鸭产蛋性能的影响。潘子意等[13]采用直接测序法检测雷州黑鸭ERRβ基因遗传多态性及其与产蛋性能的相关性分析发现内含子序列中I2-110 A>C位点的突变显著影响雷州鸭的产蛋量。张少伟等[14]使用PCR-SSC方法检测到雷州黑鸭FSHβ基因g.1103451A>T位点的TT型开产日龄均显著低于AA和AT型，而开产体质量和300日龄产蛋数则显著高于AA型，提示该位点可能促进早期产蛋和生长发育而提高雷州黑鸭的产蛋性能。因此，本研究采用直接测序法检测雷州黑鸭HAL基因的单核苷酸多态性，发现HAL基因内含子1和2区域存在7个SNPs位点，通过群体遗传多态性分析表明群体处于哈代温伯格平衡。随着人类基因组计划的启动让研究专家对基因组的奥秘逐渐清晰，内含子也从一开始不被重视的不编码的间隔区域，转换成可能也会影响机体基因功能改变的重要研究对象，如KIM等[15]构建出了HNET基因含有或不含有Intron1的报告基因，结果表明缺少Intron1会严重影响该基因细胞特异性的表达。本试验发现雷州黑鸭HAL基因内含子1和2中的7个SNPs位点与产蛋性状均显著相关，提示HAL基因内含子上的碱基突变可作为雷州黑鸭产蛋性能相关的分子遗传标记。

3.2 雷州黑鸭HAL基因7个SNPs位点与产蛋性能的相关性蛋鸭的开产日龄、开产体质量、开产蛋重和产蛋数是衡量产蛋性能的重要指标。本试验围绕雷州黑鸭HAL基因，首次发现了该基因内含子1和2中存在7个SNPs位点，并探讨了7个SNPs位点与产蛋性能指标的显著相关性，结果显示，I1-438 A>G的AA型开产日龄显著低于AG型，I2-16 C>A的AA型开产日龄显著低于AC型，I2-123 A>T的TT型开产日龄显著低于AT型，I2-141 G>A的AA型开产日龄显著低于GG型，I2-168 A>G的GG型开产日龄显著低于AA型。I1-288 C>T的CC型开产体质量显著高于TT型、I2-141 G>A的AG型开产体质量显著高于AA型和I2-168 A>G 的AG型开产体质量显著高于GG型。I1-288 C>T的TT型产蛋数显著高于CC型，I1-373 T>G的TT型产蛋数显著高于GG型，I2-123 A>T的TT型产蛋数显著高于AT型，I2-141 G>A的AA型产蛋数显著高于GA型，I2-168 A>G的GG型产蛋数显著高于AG型。相关研究表明产蛋数与开产日龄显著负相关，开产体质量与开产日龄之间存在极显著的正相关关系，产蛋数与开产体质量呈遗传负相关[16-19]，提示这7个SNPs位点的优势或较优势基因型在雷州黑鸭选育中可作为分子标记筛选出低开产日龄、低开产体质量、高产蛋量的个体，从而提高产蛋性能和经济效益。

本研究发现雷州鸭HAL基因I1-288 C>T的TT型、I1-373 T>G的TT型和I2-168 A>G的GG型可作为高产蛋量的最优基因型，同时I1-288 C>T的TT型和I2-168 A>G的GG型可作为低开产体质量的最优基因型，I2-168 A>G的GG型也可作为低开产日龄的最优基因型，为雷州黑鸭分子标记辅助育种及建立优势高产群体奠定了理论基础。

3.3 雷州黑鸭HAL基因的单倍型与产蛋性能的相关性基于单核苷酸多态性(SNP)分析只能发现保守和非保守分子功能有关的基因，而不能识别相互作用的等位基因连锁遗传，人们提出了另一种选择目标的方法——基于考虑到群体结构和个体间差异性关联的连锁不平衡(LD)。因此，本试验使用HaploView 4.2软件对雷州黑鸭HAL基因的7个SNPs进行了连锁不平衡分析，发现I1-438 A>G、I2-16 C>A、I2-123 A>T、I2-141 G>A这4个位点存在强连锁遗传，形成了7种有生物学统计意义(同种单倍型个体数n>3)的单倍型，对7种单倍型与雷州黑鸭产蛋性能进行相关性分析，发现H1H2单倍型的开产日龄显著高于H1H1、H1H3单倍型(P<0.05)；H1H2和 H1H4单倍型的开产体质量显著高于H1H1单倍型(P<0.05)；而H1H1单倍型的300 d产蛋数显著高于H1H3单倍型(P<0.05)。因此，结合7个SNPs的相关性结果，产蛋数与开产日龄显著负相关，开产体质量与开产日龄显著的正相关，产蛋数与开产体质量呈遗传负相关，提示H1H1单倍型可能为最优单倍型，可作为雷州黑鸭育种的分子标记，提高产蛋性能。

本研究发现H1H1单倍型可作为雷州黑鸭群体筛选低开产日龄、低开产体质量、高产蛋量个体的最优单倍型，为雷州黑鸭分子标记辅助育种及建立优势高产群体提供了依据。