石榴花水提物活性成分检测及抗炎作用

阿得力江·吾斯曼，张震平，特列克·阿依恒别克，艾米娜什·哈力别克，况 玲，赛福丁·阿不拉 (新疆农业大学 动物医学学院 地方药用植物研究室，新疆 乌鲁木齐 830052)

石榴花为石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥花瓣[1]。花蕾为红色，也有玛瑙、粉红、黄色和白色等，常呈四棱形，枝端多为刺状，具有良好的食用和药用价值[2]。石榴花是新疆常用药材之一，2005年石榴花被载入《中华本草·维吾尔药卷》中，据记载石榴花的主要有出汗止血、收敛止泻等功效[3]。石榴花外用于口舌发痛、出血、口臭、牙痛及肛门直肠痔疮和瘙痒等疾病的治疗[4]。石榴的皮、叶、果实、种子部分的研究较多，但对石榴花瓣的研究较少[5]。目前已从石榴花中提取的化合物有没食子酸、鞣花酸、甲基鞣花酸等，分离出的活性成分有多酚类，据报道这些活性成分具有抗炎抗氧化、降糖调脂，缓解胰岛素抵抗等功效[6-7]。

SARKER等[8]采用角叉菜胶所致鼠足肿胀动物模型观察石榴花的抗炎作用，结果表明200 mg/kg石榴花石油醚-醋酸乙酯、二氯甲烷、甲醇提取物，对角叉菜胶所致大鼠足肿胀炎症模型的抑制率分别为26.92%，27.97%，21.85%，表现出良好的镇痛抗炎作用。XU等[9]研究表明，石榴花乙醇提取物能够显著降低LPS诱导的炎症模型巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α等细胞因子的分泌及几种炎性介质的表达，表现出良好的抗炎作用。但对石榴花水提物的抗炎功效未见报道。

因此，本试验提取了石榴花水提物，对水提物中多糖、黄酮、生物碱、皂苷、多酚、蛋白等活性成分含量进行了检测；通过急性毒性试验进行安全性检测；通过耳廓肿胀试验及相关细胞因子和HE染色切片检测，确定了石榴花水提物对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀的抑制作用及抑制效果，以及石榴花水提物中所含活性成分和石榴花水提物的抗炎效果，为石榴花的进一步开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物25只雌性ICR小鼠，体质量18～22 g，购自新疆医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(新)2019-0001。

1.2 药物及试剂石榴花购自新疆维吾尔自治区民族医院；葡萄糖标准品、芦丁标准品、盐酸小檗碱标准品、没食子酸标准品、人参皂苷标准品(中国药品生物制品检定所)；磷酸氢二钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、香草醛(上海麦克林生化科技有限公司)；BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；地塞米松(广西华南药业集团有限公司)；二甲苯，多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；TNF-α，IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)；乙醇、甲醇、苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、高氯酸、冰乙酸等试剂均为分析纯。

1.3 石榴花水提物的制备称取已干燥粉碎过的石榴花300 g，过24目筛，经蒸馏水浸泡2 h，于95℃，料液比1∶10的条件下提取2 h，重复2次，合并提取液并浓缩至1 kg/L，对浓缩液高压灭菌，冷却后4℃保存备用。

1.4 石榴花水提物各有效成分含量的测定

1.4.1多糖含量的检测 通过苯酚硫酸法[10]，用葡萄糖标准品制作标准曲线，采用紫外-可见光分光光度计测定D490 nm值，检测石榴花水提物中多糖含量。

（3）当前，全市各县城镇污水处理率较低，仍然存在污水直排水功能区现象，严重污染了水功能区的水环境。各级政府应当加强污水处理厂的规划与建设，同时做好污水管网建设，以提高污水的处理率和处理质量。

1.4.2黄酮含量的检测 通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[10]，用芦丁标准品制作标准曲线，采用紫外-可见光分光光度计测定D510 nm值，检测石榴花水提物中黄酮含量。

1.4.3生物碱含量的检测 通过酸性染色比色法[11]，用盐酸小檗碱标准品制作标准曲线，采用紫外-可见光分光光度计测定D418 nm值，检测石榴花水提物中生物碱含量。

1.4.4多酚含量的检测 通过福林酚法[12]，用没食子酸标准品制作标准曲线，采用紫外-可见光分光光度计测定D765 nm值，检测石榴花水提物中多酚含量。

1.4.5皂苷含量的检测 通过香草醛高氯酸法[13]，用人参皂苷标准品制作标准曲线，采用紫外-可见光分光光度计测定D454 nm值，检测石榴花水提物中皂苷含量。

1.4.6蛋白含量的检测 按照BCA试剂盒操作说明，采用紫外-可见光分光光度计测定D562 nm值，检测石榴花水提物中蛋白含量。

1.5 石榴花水提物的急性毒性试验取14只雌性小鼠，体质量18～22 g，随机分为5组。禁食12 h但不禁水，1～5组分别灌喂1 600，800，400，200，100 g/L石榴花水提物，0.5 mL/只，灌喂前后称重。灌喂后观察小鼠精神状态，3 h后添加饲料，观察小鼠采食情况，如有小鼠死亡解剖，观察内脏。

1.6 石榴花水提物对小鼠耳廓肿胀的影响取25只雌性小鼠，体质量18～22 g，每组5只。适应性喂养3 d后，试验前小鼠禁食不禁水12 h，根据体质量和性别随机分为生理盐水模型对照组(Control，10 mL/kg)、地塞米松阳性对照组(DXM，600 mg/kg)、石榴花水提物高、中、低剂量组(500，100，50 g/L)，所有组灌胃量均为0.5 mL/只。每组连续灌胃7 d，最后1 d给药1 h后，将100 %二甲苯0.2 mL均匀涂抹于每只小鼠左耳廓两面致炎，右耳不做任何处理作为对照。致敏30 min后乙醚麻醉小鼠，后颈椎脱臼处死，剪下双耳，采用直径为7 mm的打孔器在左右耳的同样部位打下耳片。称重，以下耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率[14]。

耳肿胀抑制率=(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度。

1.7 石榴花水提物对血清中细胞因子的影响致敏30 min后乙醚麻醉小鼠，眼球取血，后颈椎脱臼处死，分离血清，按ELISA试剂盒操作说明进行，检测小鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-6的含量[15]。

1.8 石榴花水提物对小鼠耳廓肿胀的影响将打孔称重后的肿胀模型小鼠左耳迅速放入4%多聚甲醛固定液中，制作石蜡切片，HE染色，显微镜下观察病理变化。

2 结果

2.1 石榴花水提物各有效成分含量的测定如图1所示，以葡萄糖、芦丁、盐酸小檗碱、没食子酸、人参皂和牛血清白蛋白为标准分别制作多糖、黄酮、生物碱、多酚、皂苷和蛋白的标准曲线，标准曲线相关系数R2均大于0.995说明可行度高，偏差较小，能够准确反映出样品中各有效成分含量。石榴花水提物各有效成分检测结果显示，石榴花水提物中含量最多的活性成分分别为多糖和多酚，含量分别为(43.84±1.94)%，(22.44±1.62)%，其次分别为生物碱、黄酮、皂苷和蛋白，含量均低于10%(图2)。

A.多糖标准曲线；B.黄酮标准曲线；C.生物碱标准曲线；D.多酚标准曲线；E.皂苷标准曲线；F.蛋白标准曲线图1 各活性成分标准曲线测定结果

图2 石榴花水提物各活性成分含量测定结果

2.2 石榴花水提物对小鼠的急性毒性试验结果石榴花水提物在预试验给药剂量为1 600 ～100 g/L均未出现死亡及中毒现象，依照《中华人民共和国兽药典·2015 年版》中兽药急性毒性预试验评价标准，可判断石榴花水提物为无严重急性毒性的物质。

2.3 石榴花水提物对小鼠耳廓肿胀的影响结果如表1所示，与模型组相比，高剂量组能显著抑制小鼠耳廓肿胀(P<0.05)，且高剂量组的抑制效果最好；与地塞米松相比较，高、中、低剂量组无显著性差异(P>0.05)。

表1 石榴花水提物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

2.4 石榴花水提物对小鼠血清细胞因子分泌的影响如图3所示，与模型组相比，石榴花水提物及阳性药物地塞米松能显著降低模型小鼠血清IL-6、TNF-α的分泌量(P<0.05)。石榴花水提物高剂量组(500 g/L)和中剂量组(100 g/L)IL-6和TNF-α的分泌量显著低于模型组和地塞米松组，能够显著抑制耳肿胀模型小鼠体内IL-6和TNF-α的生成，石榴花水提物低剂量组(50 g/L)也有一定的抑制作用，对TNF-α的抑制效果和地塞米松组无显著性差异；对IL-6的抑制效果显著高于地塞米松组。结果表明，石榴花水提物对IL-6和TNF-α均具有抑制作用且呈一定剂量依赖型。

A.TNF-α;B.IL-6图3 石榴花水提物对耳肿胀小鼠促炎性细胞因子分泌的影响

2.5 石榴花水提物对小鼠耳片炎症组织病理的影响对各组小鼠耳片进行HE染色，200倍显微镜下进行观察，结果显示，500，100 g/L剂量组及地塞米松组，耳切片可见较轻肿胀，有少量嗜中性粒细胞和成纤维细胞浸润(图4A、B、D)；低剂量组皮下组织间隙增宽、耳片组织较轻增厚、可见血管扩张、有少量嗜中性粒细胞和成纤维细胞浸润，肿胀明显(图4C)；模型组致炎后鼠耳切片的小鼠耳片有明显肿胀、增厚，可见血管扩张，有大量白细胞浸润，耳软骨与皮肤间组织疏松(图4E)。结果表明，石榴花多糖对二甲苯所致小鼠耳肿胀具有良好的抑制作用。

图4 石榴花水提物对耳肿胀小鼠促炎性细胞因子分泌的影响

3 讨论

目前，天然药物中提取到的活性成分有多糖、蛋白质、酚类、生物碱、苷类、有机酸、挥发油等，大量研究表明这些活性成分具有不同的药用活性作用[15]。因此，检测药用植物活性成分对该植物具体药效成分的确定及进一步研发成分商品化药物具有重要意义。本试验对石榴花水提物进行了活性成分的分析，结果显示，石榴花水提物中主要成分为多糖和多酚，其次分别为生物碱、黄酮、皂苷和蛋白，可知石榴花多糖和多酚为石榴花水提物的主要活性组成成分。

炎症是一种病理反应或病理过程，主要是在炎症因子作用下发生的防御反应[16]。建立炎症反应的动物模型是研究药物抗炎作用的必要过程。该模型的建立与抗炎药的疗效评价有关[16]。在筛选抗炎药物时，一般选用以血管通透性为主要变化的急性炎症模型进行评价[17]。二甲苯致耳肿胀模型具有操作简单、稳定性好、生产成本低等优点，是国内外常用的抗炎机制模型[17]。二甲苯的作用机理是能增加毛细血管的通透性，使渗入组织的液体增多，肉眼可见红肿现象。

周霄楠等[18]研究观察青黛散水煎液对体内炎症过程的影响，采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型及棉球肉芽肿模型,试验结果显示，阳性对照组与青黛散高、低剂量(48 mg/20 g,12 mg/20 g)组的小鼠耳肿胀度均小于对照组，且差异显著(P<0.05)。蒋吉锋等[19]研究杨桃水提物对小鼠的抗炎、镇痛作用，采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀来建立炎症模型进行药物抗炎作用的检测，试验结果显示，与空白对照组相比，杨桃水提物可明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓的肿胀度。贾小舟等[20]检测盐知母多糖的抗炎作用活性，建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型，观察盐知母多糖对模型小鼠耳肿胀度、血清细胞因子分泌及HE染色切片，结果显示盐知母多糖能够显著降低模型小鼠耳肿胀度、血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子含量，表现出良好的抗炎活性。赛福丁·阿不拉等[21]研究小檗果提取物的抗炎功效，采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法观察抗炎作用,结果显示，与模型组相比，小檗果水提物和醇提物低剂量组明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀(P<0.01)。

本研究结果显示，石榴花水提物50，100，500 g/L剂量对二甲苯所致耳肿胀均有一定的抑制作用；抑制率分别为36%，57%，71%。中、高剂量组相对模型组和阳性药物地塞米松组能够显著降低血清IL-6、TNF-α的分泌量(P<0.05)；HE染色切片结果显示，中、高剂量石榴花水提物组中嗜中性粒细胞和成纤维细胞相对模型组明显减少，肿胀度明显减轻。上述结果表明，中、高剂量石榴花水提物能够明显降低二甲苯所致小鼠耳肿胀程度、改善血液中免疫细胞因子水平，同时可以减少炎性细胞的浸润，表现出了良好的抗炎活性，结合检测石榴花水提物有效成分结果可判断，其中多糖和多酚为石榴花中抗炎活性成分可能性最大。

综上所述，石榴花水提物活性成分检测及对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响结果可知，石榴花水提物能够有效抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀程度，具有良好抗炎活性，其中发挥活性药效成分为多糖和多酚可能性最大，但具体活性成分还没得到证实，有待进一步研究。