遗忘型轻度认知功能损害血浆中竞争内源性RNA网络构建及分析

张 微，洪 波，柳 安，袁梦雅，王静华，王 涛

(上海交通大学医学院附属精神卫生中心老年科，上海 200030)

人类基因组中约有80%的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)，在基因表观遗传调控、转录和转录后加工中起着至关重要的作用[1]，参与神经退行性疾病病理生理过程[2-3]。遗忘型轻度认知功能损害(amentia mild cognitive impairment,aMCI)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)早期认知障碍阶段[4]。本研究通过微阵列检测分析aMCI血浆中ncRNA差异表达，基于数据库构建了竞争内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)网络，对网络中差异信使RNA(messenger RNA，mRNA)共表达基因进行了基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，深入了解与aMCI相关的ncRNA有利于为AD开发潜在的新型生物标志物和治疗提供新策略[5]。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取来自中国纵向老龄化队列研究(CLAS，ClinicalTrials.gov标识符：NCT03672448)的受试者5例为aMCI组，同时选取5例正常人为正常对照组(normal control,NC)。两组性别、年龄和教育水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：①认知能力在数月至数年中逐渐下降；②维持日常生活能力的独立性；③缺乏血管、外伤或其他医学原因导致认知能力下降的记忆障碍证据；④认知下降不足以满足AD的标准；⑤脑18F-Flutemetamol-PET扫描Aβ阳性。排除标准：①混合或血管性痴呆者；②其他疾病所致认知障碍或痴呆者。

所有受试者或其监护人均提供了书面知情同意书，本研究通过上海市精神中心伦理委员会的批准。

1.2血浆收集及RNA提取 收集受试者5 mL外周静脉血于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min,分离心15 min后分离上层血浆。按照说明操作步骤采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)进行样品总RNA抽提，使用QIAGEN RNeasy Mini Kit(Qiagen，德国)纯化。RNA的浓度和纯度通过NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher，美国)进行质检，质检合格后进行后续的芯片实验。

1.3生物芯片技术测定基因表达谱及分析 应用miRCURY LNATM microRNA芯片(Exiqon，丹麦)测定血浆中微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱，杂交方法按照制造商的说明书进行，杂交完成后使用Wash buffer kit(Exiqon，丹麦)清洗芯片，Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值，对全部芯片进行中值标准化。通过Arraystar人类长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)V4.0芯片测定血浆中mRNA和lncRNA的表达水平，根据说明书进行操作，杂交完成后洗涤芯片，固定并使用Agilent DNA微阵列扫描仪扫描，Agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)采集芯片探针信号值，使用GeneSpring GX v12.1软件进行芯片数据标准化以便进一步分析。选取符合表达差异倍数(fold change，FC)对数的绝对数|log2FC|≥1和P<0.05两个条件miRNA，即lncRNA和mRNA为差异有统计学意义的基因。

1.4lncRNA-miRNA-mRNA调控网络构建 使用PicTar 2005(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrat)、miRanda v5(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)和TargetScan 5.1(http://www.targetscan.org/)数据库预测非编码RNA之间相互作用，将数据库预测结果进行交叉，得到lncRNA-miRNA，miRNA-mRNA之间的关系以及差异表达miRNA调控的基因。根据不同的表达miRNA靶基因预测结果以及miRNA和lncRNA关联分析数据，使用Cytoscape软件分析并获得了最终的ceRNA调控网络图。

1.5差异miRNA 靶基因的功能分析 通过DAVID(http://www.david.abcc.ncifcrf.gov/)在线数据库进行GO和KEGG分析并探讨靶基因的功能作用。

1.6统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。计算高通量测序相关数据使用R软件进行统计计算，设定差异有统计学意义的lncRNA和mRNA的阈值为|log2FC|≥1和P<0.05。

2 结 果

2.1miRNA芯片数据概述 Exiqon的miRNA阵列产生miRNA共3 100个，涵盖在miRBase 19.0中注释的所有人类、小鼠和大鼠miRNA，以及与这些物种相关的所有病毒miRNA，去除低质量的miRNA、小鼠和大鼠的miRNA后，检测到成熟miRNA 1 939个，其中aMCI组中有失调miRNA46个，包括上调miRNA13个和下调miRNA33个，见图1A，如hsa-miR-145-3p，hsa-miR-5691，hsa-miR-3156-3p，hsa-miR-622和hsa-miR-4638-3p是下调的miRNA。进行了miRNA表达的聚类分析，生成了一个热图，见图1B。

2.2lncRNA与mRNA芯片数据概述 lncRNA微阵列芯片产生总共40,173个lncRNA和蛋白质编码mRNA20,730个，每个转录物均由特定的外显子或剪接点探针表示，该探针可唯一地准确识别单个转录物。aMCI组共有严重失调的lncRNA287个，包括上调的lncRNA67个和下调的lncRNA220个，见图1C。通过聚类分析热图可视化lncRNA的表达，见图1D。aMCI组有显著失调mRNA208个，其中上调mRNA48个和下调mRNA160个，见图1E，对mRNA表达进行聚类分析生成一个热图。见图1F。

图1 遗忘型轻度认知功能损害受试者外周血浆miRNA、ln-cRNA、mRNA表达谱A.miRNA表达火山图;B.miRNA表达热图;C.lncRNA表达火山图;D.lncRNA表达热图;E.mRNA表达火山图;F.mR-NA表达热图Figure1 ExpressionprofilesofmiRNAs,lncRNAandmR-NAinperipheralbloodplasmaofaMCIgroup

2.3lncRNA-miRNA-mRNA调控网络构建 根据ceRNA假设，ceRNA可以在调节网络中竞争相同的MRE。一个lncRNA可以不同的方式调控多种miRNA，而一种miRNA则可以由多种lncRNA调控。使用PicTar、miRanda和TargetScan三个数据库对微阵列芯片数据进行分析后有lncRNA 3个、miRNA 5个、mRNA 7个参与构建了遗忘型轻度认知功能损害ceRNA调控网络，调控关系见图2。如，lncRNA T093863与失调miRNA 70个相关联，显示hsa-miR-145-3p在微阵列结果中下调。LncRNA可以竞争性地结合miRNA结合，从而间接调控miRNA靶基因。

图2 aMCI组中ceRNA网络图

2.4差异miRNA 靶基因的功能分析 对差异表达的mRNA的功能进行GO分析。GO显示差异表达mRNA主要富集在RNA代谢过程(GO：0051252)、基因表达的调控(GO：0010468)，细胞质应激颗粒(GO：0010494)、细胞核(GO：0005634)、蛋白激酶B结合(GO：0043422)和微管正端结合(GO：0051010)等生物学过程，见图3。

图3 差异表达mRNA的靶基因GO分析

进行KEGG通路分析以确定基因相关信号传导通路，显示8条KEGG通路与上调mRNA相关，差异有统计学意义(P<0.05)，包括单纯疱疹病毒1感染，催产素信号、甘露糖型O聚糖生物合成、叶酸生物合成、EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药性、大肠癌、甲状腺癌和IL-17信号通路，见图4。

图4 差异表达mRNA的靶基因KEGG分析

3 讨 论

AD是常见的神经退行性疾病，其病理机制仍不确定，随着中国社会进入老龄化，该病给医疗护理和社会经济带来的负担日益严峻。研究表明，ncRNA在AD病理生理进程中发挥重要作用[6]，AD病理生理改变在临床症状出现前已存在。aMCI被认为是AD进展的无症状阶段，找到aMCI失调ncRNA可以促进其作为生物标记物的开发和AD治疗的新靶点，对AD预防、诊断及治疗均有非常重要的意义[7]。本研究中，对aMCI受试者和对照组外周血浆中的lncRNA、miRNA和mRNA表达谱进行微阵列分析，获得差异有统计学意义的基因，使用|log2FC|≥1和P<0.05的阈值，显示aMCI组和NC组存在差异有统计学意义的上调lncRNA 67个和下调lncRNA220个，上调miRNA 13个和下调miRNA 33个，上调48个mRNA和下调mRNA 160个。使用PicTar、miRanda和TargetScan三个数据库对其相互作用进行预测，通过可视化的软件 Cytoscape建立ceRNA网络，揭示三者的相互作用关系。既往研究显示，此差异表达的RNA与AD的发病机制有关，如SPSB1与MCI向AD的转化有关，而NPLOC4在神经退行性疾病(帕金森病、精神分裂症和AD)中表现出多效作用[8]。

LncRNA是一种调节各种生物学功能的主要非蛋白编码转录本[9]。越来越多的证据表明，lncRNA可以作为ceRNA干扰miRNA，发挥“海绵”的作用，从而影响其常见的mRNA功能。研究报道癌症研究领域中的ceRNA机制和网络构建[10]，但对于神经退行性疾病的ceRNA调节机制探索较少。本研究中，构建了一个lncRNA-ceRNA网络，以研究aMCI患者血浆中lncRNA和miRNA之间的潜在关系，以及其在AD病理生理过程中发挥的潜在作用。在本研究构建的ceRNA网络中，lncRNA T093863与SNX32彼此竞争影响miR-145表达，在淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡中可能发挥特定作用。研究显示，SNX32与AD风险增加有关[10]，SNX32在aMCI血浆中表达上调，其特异性表达可能是AD的最佳生物标志物。MiR-145在癌症中发挥抑癌作用[11]，在AD发病过程中也拥有至关重要的作用，MiR-145可以通过Aβ-p53途径，增强p53的免疫反应性，而p53免疫反应性与AD中淀粉样蛋白诱导的细胞死亡有关[12]。上述失调RNA或可作为早期诊断 AD 的潜在生物标志物及治疗靶点，需进一步扩大样本进行临床实验加以证实。尚不清楚AD中lncRNA T114520和lncRNA T118670的功能，但两者均可通过调节miRNA进而上调含C2域蛋白3的mRNA和蛋白水平。WWC蛋白家族的支架蛋白WW和含C2域蛋白3通过抑制Hippo通路中主要效应物的转录活性在调节细胞增殖，细胞迁移和突触信号传导中起重要作用[13-14]。在AD患者中抗Aβ抗体和γ-/β-分泌酶抑制剂的临床试验失败后[15-17]，找到新的AD治疗策略至关重要。在调节细胞增殖、凋亡和炎症反应中起重要作用的Hippo信号通路与MCI的早期神经元死亡有关。细胞内生成的Aβ通过隔离YAP相关蛋白，损害YAP相关蛋白的功能进而引起了神经元坏死，减少了脑神经元的数量。因此，需进一步探索在Aβ产生之前的某个阶段的遗传调控机制并进行干预，减少Aβ产生。lncRNA T114520和lncRNA T118670可以作为AD早期治疗的潜在靶点，但目前对于lncRNA T114520和lncRNA T118670知之甚少，还需进一步完善相关实验，探索其在AD中的生物学和分析机制。在构建的ceRNA网络中，本研究显示，与淀粉样蛋白诱导的细胞死亡相关的miRNA、lncRNA和mRNA之间的新关系，为进一步研究提供了潜在的治疗靶点和诊断相关的生物标志物。

本研究对ceRNA网络中差异表达mRNA及其共表达基因进行GO富集和KEGG分析，以更好地了解差异表达的RNA在AD发病机制中的生物学功能和潜在机制。GO分析显示，其主要参与RNA代谢过程，调节基因表达、细胞质应激、细胞核功能，调节转录因子活性和DNA相关转录因子活性等生物过程，可见在疾病早期异常调节的RNA参与了基因表观遗传调控及转录和转录后加工过程，影响了疾病的病理生理过程。KEGG分析显示其参与了单纯疱疹病毒1感染途径、催产素信号传导途径、甘露糖型O-聚糖生物合成途径、叶酸生物合成途径、EGFR酪氨酸激酶抑制途径等通路。

本研究首次分析了AD无症状阶段的aMCI患者外周血浆中失调的lncRNA、miRNA、mRNA，可作为潜在的AD早期诊断生物学标志物，同时本研究还构建了差异表达RNA的ceRNA网络并进行分析，显示lncRNA T114520-has-miR-622-含C2域蛋白3等调节通路明显失调，可能是AD发生发展的重要因素，通过调节相关通路，或可以为AD发生的分子途径和治疗策略提供新观点。