超高压大豆蛋白酶解物体外消化产物的抗氧化活性研究

关海宁，徐筱君，孙薇婷，刘登勇，刁小琴

（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

大豆分离蛋白（Soybean Protein Isolation，SPI）是大豆的主要组成成分之一，约占总蛋白的40%[1]。高压处理对大豆蛋白结构的改变和功能性质的改善具有较大的潜力[2-3]，进而使大豆蛋白有目的、有方向性地表现出更好的功能特性，实现蛋白质功能性质的多元化，从而使蛋白质的利用价值得到提高[4]。高压协同酶法水解蛋白获得的水解产物具有诸多优良的特性，安全无毒。Singh等[5]通过研究发现，在350 MPa高压环境下，浓度为10%卵清蛋白经胰蛋白酶水解5 min，其水解产物的抗氧化活性为19%，而未经高压处理的对照组仅为9.34%。Peñas等[6]研究了超高压100～300 MPa条件下，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、内肽蛋白酶对乳清蛋白水解性能和产物功能性的影响，发现压力为200 MPa和300 MPa协同酶解作用能够降低乳清蛋白中过敏原蛋白段的致敏性。Garcia-mora等[7]考察了在100～300 MPa下，不同蛋白酶（复合蛋白酶、蛋白酶、胰蛋白酶以及碱性蛋白酶）对扁豆蛋白水解效果的影响，结果表明：300 MPa下的酶水解使扁豆蛋白完全变性，并且增强了小于3 kDa水解肽的富集，同时提升了水解产物在消化过程中抑制血管紧张素转移酶和氧自由基的吸收能力。Roy等[8]使用不同种类的酶水解深红芸豆蛋白，研究其水解产物的抗氧化活性，结果发现：经胃蛋白酶水解的芸豆分离蛋白具有较强的DPPH自由基清除能力。然而关于蛋白高压酶解物在经过人体消化后，其抗氧化活性的变化鲜见报道。

模拟体外胃肠消化具有操作简便、成本低、人性化等优点。因此，本试验采用体外模拟人体胃肠消化的方法，在评价超高压对大豆分离蛋白结构影响的基础上，研究高压酶解产物在不同消化阶段消化产物的抗氧化活性的变化，以期为开发天然抗氧化功能肽提供理论依据，对大豆产物综合开发的高新技术推广与应用奠定理论基础和实践经验。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

脱脂低温豆粕（食品级）：哈高科大豆食品有限公司。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；Corolase PP（4 000 U/g，来自猪胰脏）：南京庞博生物工程有限公司；胃蛋白酶（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；胰脂酶和猪胆盐：美国Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备

HHP-400超高压设备：沈阳人和机电工程设备有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析有限公司；F4500荧光分光光度计：日本日立有限公司；DDS-307型pH计：上海雷磁仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；普利赛斯XS系列原装电子天平：上海锐析仪器设备有限公司；TDL-80-2B低速台式离心机：湖南星科科学仪器有限公司；XH-C漩涡混合器：金坛市白塔新宝仪器厂；HD2010W电动搅拌器：上海司乐仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

参照Jiang等[9]制备大豆分离蛋白的方法，以脱脂低温豆粕为原料制备大豆分离蛋白，并将其用0.2 mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲液配制30 mg/mL的大豆分离蛋白溶液，一部分用于直接高压处理，另一部分加入底物质量3%的Corolase PP酶混匀，将未加酶与加酶的蛋白溶液分别装入3个双层聚乙烯塑料袋中，每袋50 mL，抽真空密封后，置于高压设备中，于50℃下进行高静压处理，以蒸馏水作为压力传递介质，设定处理压力分别为100、200、300 MPa，每个压力下的处理时间均为4 h，以常压处理（0.1 MPa）为对照（CK）。高压处理结束后，未加酶组冷却至室温，而加酶的处理组沸水浴灭酶10 min后冷却至室温，所有处理组均在4℃条件下8 000 r/min冷冻离心10 min，上清液冷冻干燥，高压处理的SPI与高压水解的大豆分离蛋白酶解物均于4℃保存备用。

1.2.2 色氨酸荧光光谱分析

参照Liu等[10]的方法并略作修改。使用10 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液将高压处理后的SPI样品配制成0.2 mg/mL蛋白溶液。为了减少二聚酪氨酸的干扰，使用F-4500型荧光分光光度计在激发波长295 nm下以5 nm/s的速度扫描得到300～400 nm范围的发射光谱，以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）为空白。

1.2.3 大豆分离蛋白高压酶解物的体外模拟消化研究

参考Li等[11]的方法，稍有改动。称取2.4 g不同高压处理的大豆蛋白酶解物，将其置于180 mL三口烧瓶中，加入50 mL蒸馏水，混合均匀，沸水浴5 min后冷却至37℃，然后加入模拟胃液50 mL（37.5℃），混合均匀，将三口烧瓶置于37.5℃水浴中，进行电动搅拌（150 r/min）。反应时间4 h，每隔1 h取15 mL反应液，并迅速进行15 min沸水浴灭酶，冷却后离心20 min（4 000 r/min），取上清液，将其置于0～4℃冰箱中保存。将上述剩余的反应液用1 mol/L NaHCO3调节pH至5.5，加入预热的模拟肠液150 mL，并用1 mol/L NaOH调节pH值至7.5，于37.5℃水浴中电动搅拌（150 r/min）。反应时间6 h，每隔1 h取15 mL反应液，并迅速进行沸水浴灭酶15 min，冷却后离心20 min（4 000 r/min），取上清液在0～4℃冰箱中保存。

1.2.4 消化液抗氧化活性测定

不同时间段消化产物还原能力：参照Ma等[12]的吸光值法测定；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）清除能力：参照张淼[13]的方法测定；超氧阴离子自由基（O2·）清除能力：参照Chen等[14]的方法测定；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS+·）清除能力：参照宋佳天[15]的方法测定；羟自由基（·OH）清除能力：参照金鸣等[16]的方法测定。

1.2.5 抑制脂质体氧化能力测定

参照李媛媛等[17]的方法进行不同时间段消化产物的抑制脂质体氧化能力的测定。

1.2.6 数据处理

每个试验重复3次，结果表示为x¯±s，采用Statistix 8.1软件进行数据统计分析，采用Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 超高压条件下大豆分离蛋白内源荧光光谱分析

通常蛋白质分子中含有一些内源荧光的氨基酸残基，但是由于色氨酸残基和酪氨酸残基空间位置的改变导致两者之间的能量发生了转移，表现为酪氨酸残基荧光熄灭而色氨酸残基荧光增强，因而蛋白质的荧光主要是色氨酸残基的荧光[18]。当蛋白质结构发生改变时，色氨酸残基的位置和微环境会发生改变，表现出荧光光谱发生变化，进而可以反映蛋白质三级结构的变化[19]。图1是超高压下大豆分离蛋白与常压对照组在310～370 nm范围内的荧光扫描图。从图中看出，对照组荧光出峰波值为334 nm，经过超高压处理后，样品的λmax发生了一定的红移（向长波方向移动），虽然红移的幅度较小，但仍可以表明其三级结构发生改变，使得色氨酸荧光基团更倾向于亲水的微环境[20]。

图1 超高压处理后大豆分离蛋白的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of soybean protein isolates after ultrahigh pressure treatment

与此同时，就荧光峰值的强度而言，经过高压处理后各样品的强度随着压力的升高均呈现不同程度的升高，这表明更多的色氨酸基团在整个蛋白结构中暴露或包裹的残基比例发生变化；然而当压力升到300 MPa，对比200 MPa，荧光强度反而降低，可能是300 MPa的高压使蛋白质分子间发生了聚集变性。苏丹等[21]也报道利用300 MPa处理大豆蛋白的相对荧光强度较200 MPa处理样品的荧光强度有所降低，说明200～300 MPa可能导致了蛋白的可逆变性。

2.2 超高压大豆分离蛋白酶解物体外消化产物的抗氧化性研究结果

2.2.1 消化过程中还原力的变化

图2是超高压下大豆分离蛋白酶解物体外消化产物铁还原能力的变化曲线。从图中看出：水解物在胃部消化阶段，还原能力上升缓慢，说明铁离子与消化不充分的大豆分离蛋白酶解物消化产物的金属螯合能力较弱；然而进入肠消化阶段，随着消化时间的延长，其还原能力逐步增强，特别是在4～6 h时出现“爬坡”式攀升，但在随后的肠消化过程中，其铁还原能力趋于平稳。这说明大豆分离蛋白酶解物在肠部消化过程中，由于肽键的裂解一方面使得更多的含组氨酸、苏氨酸等非特异性蛋白组分暴露[22]，这些组分增强其还原能力的表现效果，另一方面随着大豆分离蛋白酶解物消化程度的加深，更多的小分子多肽暴露，其更容易与铁离子结合[23]，增强消化产物的抗氧化能力。消化6 h后，还原能力上升趋于平缓，可能是大部分酶解物已消化完成。在整个消化过程中，200 MPa处理的大豆分离蛋白酶解物的消化液铁还原能力始终最强，可能是因为200 MPa压力对于大豆分离蛋白原有的结构影响较大，产生了特异性构象，与此同时在酶解的过程中形成了部分特有的多肽结构。这一结果与上述荧光表征得出的结论相一致。另外，在之前的研究中也发现，200 MPa处理的大豆分离蛋白酶解物与其他处理组相比产生了较多的小分子短肽[6]，林燕等[24]也发现分子量小于3 kDa的核桃小分子短肽具有较强的铁还原能力。

2.2.2 消化过程中自由基清除能力的变化

由图3可以看出，随着消化时间的延长，消化产物对于ABTS自由基清除率表现为先下降后上升的趋势，至胃蛋白酶消化后（4 h）清除率最低，一方面可能由于在胃消化阶段，未消化完全的大分子蛋白消化液易与脂溶性DPPH自由基结合，进而阻碍了与水溶性ABTS自由基的结合[25]；另一方面可能是消化过程中较多疏水氨基酸侧链的暴露影响了其与ABTS自由基的结合，因而清除率降低，但随着胰蛋白酶的介入，蛋白继续水解，更多的短肽和游离氨基酸不断产生，其亲水性得到改善，进而促进了ABTS自由基清除率的提高[26]。

图3 消化液对ABTS自由基清除率的影响Fig.3 Effect of digestive juice on ABTS free radical scavenging rate

由图4看出，在整个消化过程中，消化产物对于DPPH自由基清除率表现为先逐步上升，这可能是由于DPPH自由基属于亲脂性自由基，在疏水氨基酸侧链暴露较多的条件下，更容易与之形成反应体系；然而当进入肠部模拟时，体系中亲水氨基酸逐渐增加，破坏了原有的反应体系，使得反应优势骤降，在随后短肽不断产生的过程中，水解产物与油溶性DPPH自由基结合能力减弱，清除能力表现为轻稳平升的态势[13]。

图4 消化液对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of digestive juice on DPPH free radical scavenging rate

与常压对照组相比，200 MPa和300 MPa处理下大豆分离蛋白酶解物的消化液对ABTS·、DPPH·清除率均表现出比较好的优势，且200 MPa处理的酶解物其消化产物的清除能力更强，这可能与最初该压力对其结构的关键性改良及产生了较多的小分子肽有关[6]。

图5显示了超高压下得到的大豆分离蛋白酶解物体外消化液对超氧阴离子自由基清除率的影响变化趋势。由图5可以看出，随着消化时间的延长，超氧阴离子自由基的清除能力呈现上升的趋势，特别是进入到肠道消化阶段，其递增速度出现大幅度提升，而后又转为平稳提升，这可能是由于大豆分离蛋白酶解物在模拟肠道消化后水解产物能更有效地提供H质子，进而提高了超氧阴离子自由基的清除能力，这一结论与王正旋[27]考察大米蛋白对超氧阴离子自由基清除的结果趋势相一致。

图5 消化液对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.5 Effect of digestive juice on superoxide free radical scavenging rate

由图6看出，在模拟胃部消化阶段，羟自由基的清除能力呈缓慢下降趋势，这可能是由于胃蛋白酶与部分疏水性氨基酸的羧基端或氨基端作用，进而使羟自由基与多肽的结合能力减弱[28]；然而在模拟肠道消化阶段，羟自由基清除能力又稍有小幅上升，这可能是酶解后增加的小分子多肽提高了羟自由基的清除能力。羟自由基在胃肠道消化阶段不同的清除能力可能与蛋白分子在胃、肠道消化过程中产生的不同短肽有关，该结果与张淼[13]对玉米蛋白模拟体外消化的研究结果相一致。

图6 消化液对羟自由基清除率的影响Fig.6 Effect of digestive juice on hydroxyl free radical scavenging rate

通过对图5和图6的进一步分析得出，200 MPa处理样品的消化液在消化10 h时，超氧阴离子自由基清除率最高，达到79.7%，这与ABTS·和DPPH·清除率的影响效果相似；而消化液在消化4 h时，羟自由基清除率达58.6%，所有处理中最高，这进一步证实该压力对大豆分离蛋白的改造具有较强的优势，同时结合酶解并形成了功能突出的特异性多肽结构。

2.3 超高压大豆分离蛋白酶解产物体外消化产物抑制脂质体氧化能力的分析

脂肪氧化的次级产物丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成的硫代巴比妥酸反应物（TBARS），它是脂质氧化过程中常用来评价被测物抑制脂肪氧化的重要指标之一。由图7可以看出，不同高压处理的大豆分离蛋白酶解物体外消化液的TBARS值呈现先升高后降低再缓慢升高的趋势，特别是进入肠道消化阶段，其下降趋势呈现“断崖”式跌落，这说明在进入到肠道消化后，消化液中的部分蛋白结构被破坏，具有抗氧化活性的基团暴露，抑制了丙二醛的形成，进而使TBARS值降低。此外，从该图中还可以得出一个抗氧化表征共性的现象，即经过200 MPa处理的样品依然在此项研究中表现出良好的抗脂质氧化的效果，在消化5 h时TBARS值最低，为0.369 mg/L。该研究结果与李媛媛等[17]对玉米蛋白水解物抑制脂质氧化的研究结论相一致。

图7 模拟消化过程中抑制脂质体氧化能力的变化曲线Fig.7 Curve of inhibiting liposome oxidation during simulated digestion process

3 结论

上述试验结果表明：超高压对大豆分离蛋白结构具有一定的改性作用，通过对其进行荧光光谱扫描，发现在超高压200 MPa条件下，一方面大豆分离蛋白的结构会发生特异性变化，另一方面蛋白也可能会发生重新结合或聚合，使其结构趋于更加稳定，这就使得在超高压结合酶的作用下，其水解产物更可能产生特殊形式及结构的多肽组分；对不同压力下的酶解产物进行体外消化试验，得出经超高压200 MPa处理的大豆蛋白酶解物在体外消化10 h时还原能力最强（0.462），超氧阴离子自由基清除能力最强（79.7%），ABTS自由基清除能力最强（4.5%），在消化4 h时DPPH自由基清除率最高（96.8%），羟自由基清除率最高（58.6%），在消化5 h时抑制脂质体氧化能力最强，其TBARS值最低，为0.369 mg/L。本研究对揭示因超高压诱导蛋白水解物结构变化从而影响体外消化产物抗氧化活性的作用机制提供了一定的理论依据，并对其促进抗氧化功能食品开发与应用具有一定的参考作用。