黑美人马铃薯结合态和游离态多酚氧化酶的酶学性质研究

刘 辉，卢 扬，李 俊，范士杰，王立新，王 辉,*

（1.贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；3.贵州省毕节市农业技术推广站，贵州 毕节 551700）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）含有铜离子，广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中[1]。在有氧条件下，PPO先将单羟基酚氧化成邻二酚，再将邻二酚氧化成邻醌，最后聚合成褐色素[2]。一般认为，PPO在植物细胞内存在游离态（Soluble PPO，sPPO）和膜结合态（Membrane-bound PPO，mPPO）两种形式，且这两类同工酶间的性质差异较大[3-5]。当细胞膜结构受到破坏，mPPO便游离出来，从而使PPO酶活力显著提高，引起果蔬褐变，造成变色、变味、软化及营养下降等不良后果，导致果蔬的市场价值降低[6-7]。

由于mPPO的存在，使PPO的酶活力问题研究起来十分复杂。目前，国内外已经开始对膜结合态PPO进行研究，并且取得了较好的研究结果。如Zaini等[8]通过非离子型去污剂Triton X-114、热诱导相分配技术、硫酸铵沉淀法及琼脂糖凝胶层析等技术，成功地从蛇皮果中分离纯化出膜结合态多酚氧化酶，并对它的酶学特性进行了研究；Liu等[3]通过硫酸铵沉淀法及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换法对苹果膜结合态PPO进行了纯化，并研究了其三维结构，同时与苹果的游离态PPO的性质进行了比较，发现它们在一定pH值及温度范围内的酶活力有差异，膜结合态PPO酶活力要显著高于游离态，且反应的最适底物也不一致。在马铃薯PPO的研究中，为降低马铃薯块茎发生的酶促褐变，探究其PPO的性质，对马铃薯PPO进行分离和性质研究受到广泛关注。目前，对游离态PPO的分离纯化及性质研究较多，如孟雅等[9]采用硫酸铵分级沉淀法、凝胶层析法及分级沉淀和层析相结合的方法对马铃薯PPO进行了纯化，并研究了其在不同工艺条件下的酶活力变化。对马铃薯膜结合态PPO的研究仍属空白，且尚无可靠的分离纯化方法，对其性质更是缺乏系统的了解。课题组前期已经完成了大西洋马铃薯sPPO与mPPO酶学性质的研究[10]，但是不同品种（系）马铃薯块茎酶促褐变程度不同，且不同品种（系）马铃薯PPO分离方法及酶学性质也存在差异[11-12]。黑美人马铃薯是我国自主培育出的彩色优质马铃薯新品系，因其富含花青素，所以具有抗氧化作用[13]。该品种由贵州省生物技术（马铃薯）研究所从国际马铃薯中心引进，并已经成为贵州省冬作区的主要栽培品种之一。本试验以黑美人马铃薯为原料，分别提取sPPO和mPPO粗酶，并对两种酶进行酶学性质研究，为进一步了解PPO性质和提升特色马铃薯资源优势提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

黑美人马铃薯块茎，为贵州省生物技术研究所提供的新鲜马铃薯。

磷酸氢二钠、聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、间苯二酚、焦性没食子酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、绿原酸等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Infinite M200 Pro NanoQuant酶标仪，瑞士Tecan Group Ltd；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；TGL-20台式高速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；A11基本型分析研磨机，艾卡（广州）仪器设备有限公司；HH-1恒温水浴锅，常州市金坛区环宇科学仪器厂；SB-5200DTS超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UPT-II-10T超纯水机，西安优普仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯PPO粗酶液提取方法

马铃薯PPO粗酶液提取参考苹果[3,14]和梨[5]PPO的提取方法。将200 g马铃薯洗净、切块，加入0.05 mol/L、pH值为6.8的预冷磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（含2%的交联聚维酮（PVPP）），料液比1∶1（g/mL），经研磨机研磨搅碎，4℃下，10 000 r/min离心20 min，上清液即为sPPO粗酶液。沉淀用5倍体积去离子水冲洗干净，按固液比1∶2（g/mL）加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、0.15%Triton X-100匀浆，室温下超声（超声功率为360 W）处理10 min并静置1 h；4℃下11 000 r/min离心15 min。置于冰箱30 min，然后35℃水浴保温15 min。25℃离心15 min，上清液即为mPPO粗酶液。

1.2.2 马铃薯PPO特征吸收波长的确定

利用紫外分光光度计测定特征波长[15]。以邻苯二酚为底物，用0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.8）配制成底物溶液，取2.5 mL底物溶液，加入0.5 mL PPO粗提液，混匀，在25℃下对混合液进行波长扫描，确定特征吸收波长。

1.2.3 PPO酶活力测定

以邻苯二酚为底物分别测定马铃薯sPPO和mPPO的酶活力。PPO酶活力测定方法如下：用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.8）配制邻苯二酚（0.01 mol/L）底物溶液[15]。将0.3 mL酶液与2.5 mL上述缓冲液混合后，加入0.2 mL底物溶液开始反应。用分光光度计测定反应液1 min内在特征吸收波长下的吸光度变化值（A1）。对照煮沸10 min的相应酶液的吸光度值（A0）。在测定条件下吸光度值改变0.001所需的酶量为一个酶活单位（U）。

式中：t为反应时间，min；M为粗酶蛋白的质量，mg。

1.2.4 PPO蛋白浓度测定方法

以考马斯亮蓝法进行蛋白含量测定。取10μL酶液于酶标板中，依次加入10μL磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2）、200μL G250染色液（0.01%），室温下反应10 min，置于酶标仪中于595 nm下测定吸光度值。以牛血清蛋白（BSA）为标样制作蛋白标准曲线。

1.2.5 pH值对PPO酶活力的影响

依照“1.2.3”的方法测定PPO酶活力，其中酶反应缓冲液分别选定pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的0.05 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液[3]。将测得的最大单位酶活力值记为100%，计算其他反应pH值下的PPO相对酶活力。

1.2.6 反应温度对PPO酶活力的影响

先将缓冲溶液和底物溶液分别置于温度为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴槽中预热10 min，然后迅速加入0.3 mL酶液，混匀，分别测定酶活力。将测得的最大单位酶活力值记为100%，计算其他反应温度下的PPO相对酶活力。

1.2.7 底物对PPO酶活力的影响

以邻苯二酚、间苯二酚、绿原酸和焦性没食子酸溶液为底物，在底物浓度分别为10、20、30、40、50 mmol/L条件下测定酶活力。

1.2.8 PPO动力学常数测定

依照“1.2.3”的方法对PPO酶活力进行测定，其中反应底物分别选用反应体系中终浓度分别为4、12、16、20、24、30 mmol/L的邻苯二酚、焦性没食子酸溶液，作反应底物浓度与单位酶活力的双倒数图，根据斜率公式计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）值。

1.2.9 抑制剂对PPO酶活力的影响

分别以乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、亚硫酸钠、抗坏血酸、草酸、植酸、柠檬酸、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+为抑制剂，依照“1.2.3”的方法对PPO酶活力进行测定（以上抑制剂终浓度均为1.00 mmol/L），将未加抑制剂的酶样品单位酶活力值记为100%，计算添加不同浓度抑制剂的PPO相对酶活力。

1.2.10 PPO热稳定性测定

依照Zhou等[5]的方法略作修改后进行测定。将sPPO和mPPO粗酶提取液分别置于30、40、50、60℃水浴锅中保温10 min后立即冷却至室温，依照“1.2.3”方法对PPO酶活力进行测定。将未经热处理的酶样品单位酶活力值记为100%，计算添加不同温度下PPO残留酶的相对酶活力。

1.2.11 数据处理

所有数据进行3次重复试验，结果以x¯±s表示。使用SPSS 18.0对数据进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 黑美人马铃薯sPPO和mPPO粗酶液的制备

黑美人马铃薯PPO经提取后，分别得到sPPO和mPPO粗酶液。经测定，两种粗酶液的蛋白浓度分别为（5.51±0.01）mg/mL和（0.30±0.01）mg/mL。由于邻苯二酚最大吸收波长为277 nm，且在可见光区无吸收，故从图1可知，sPPO和mPPO的最大吸收波长分别为403 nm和406 nm。周向军等[16]研究也发现，黑美人马铃薯PPO的最大吸收波长为413 nm，与本研究结果相似。一些研究中，PPO最大吸收波长为420 nm，推断跟不同马铃薯品种的PPO性质不同有关，或者与粗提液中同工酶的作用有关，也可能由于PPO与底物反应产生的产物存在差异[3,7,16]所致。

图1 黑美人马铃薯mPPO与sPPO的波长扫描图Fig.1 Wavelength scanning charts of mPPO and sPPO in black beauty potatoes

2.2 pH值对黑美人马铃薯PPO粗酶活力的影响

不同pH值对马铃薯sPPO和mPPO粗酶活力的影响见图2。如图2A所示，当pH值为7时，sPPO和mPPO的相对酶活力均达到最大；当pH值为8时，sPPO和mPPO相对酶活力分别为50.54%±0.28%和72.31%±0.58%，均极显著低于pH7时的活力（P＜0.01）；当pH值小于7时，sPPO和mPPO相对酶活力均随pH降低而减小，但sPPO的相对酶活力高于mPPO，表明sPPO在酸性条件下比mPPO更稳定。李瑜等[17]测得马铃薯中薯5号、中薯6号和费乌瑞它的PPO粗酶最适pH值为5.5，而王清等[18]测得甘农薯1号和甘农薯2号的PPO粗酶最适pH值分别为5和5.5。以上马铃薯PPO最适pH值均小于等于5.5，而在本试验中，黑美人马铃薯sPPO和mPPO粗酶的最适pH值均为中性，与以上报道存在明显差异，这表明不同品种马铃薯PPO最适pH值存在差异性。用绝对酶活力进一步对sPPO和mPPO的酶活力进行比较，结果如图2B所示，在测试的所有pH值下，mPPO的绝对酶活力均高于sPPO。类似的结果也发生在红富士苹果[3]和梨[5]的PPO中，推测跟两种PPO在三维结构上存在酶的基团重排、同工酶或不同的酶活性中心相关[3,19]。

图2 pH对马铃薯sPPO和mPPO粗酶活力的影响Fig.2 Effects of pH on sPPO and mPPO activities in potato

2.3 反应温度对黑美人马铃薯PPO粗酶活力的影响

不同反应温度对马铃薯sPPO和mPPO粗酶活力的影响如图3所示。从图3A可知，sPPO和mPPO的最适反应温度分别为25℃和30℃；当反应温度为20～70℃时，sPPO和mPPO粗酶的相对酶活力均呈现先增大后减小的变化趋势，其中，当温度为20℃时，sPPO和mPPO的相对酶活力分别为97.13%±0.56%和96.43%±0.42%，当温度升至70℃时，sPPO和mPPO的相对酶活分别降为26.55%±0.56%和27.41%±0.84%。此外，温度为25～70℃时，mPPO的相对酶活力比sPPO高，表明mPPO比sPPO更耐受高温。王清等[18]报道，马铃薯品种Favorita和Snowden块茎的PPO最适反应温度为25℃；张洪等[20]和李瑜等[17]均报道马铃薯PPO最适反应温度为30℃，表明不同品种马铃薯的块茎多酚氧化酶最适反应温度不一致。而在本试验中，黑美人马铃薯sPPO和mPPO粗酶的最适反应温度略有不同，绝对酶活力存在差异（如图3B所示），造成这种差异性的原因在于sPPO和mPPO所处的环境不一样，导致酶活性中心与环境中底物的结合能力受影响[3,21]。

图3 温度对马铃薯sPPO和mPPO粗酶活力的影响Fig.3 Effects of temperatures on sPPO and mPPO activities in potato

2.4 底物对黑美人马铃薯PPO粗酶活力的影响

分别以不同浓度的邻苯二酚、间苯二酚、绿原酸和焦性没食子酸为底物和sPPO、mPPO粗酶进行反应，对马铃薯两种PPO粗酶的酶活力进行测定。结果表明，以绿原酸和间苯二酚为底物进行反应时均未检测到酶活力，说明绿原酸和间苯二酚不是测定马铃薯PPO酶活力的底物。相关研究发现间苯二酚也不适合作为测定勐库大叶种茶树PPO酶活力的底物[22]。如图4所示，当以邻苯二酚和焦性没食子酸为底物时mPPO酶活力均大于sPPO。当邻苯二酚浓度为10 mmol/L时，sPPO和mPPO的酶活力均较低，分别为5.57 U/mg和17.07 U/mg；当焦性没食子酸浓度为10 mmol/L时，sPPO和mPPO的酶活力分别为4.19 U/mg和18.97 U/mg。Batista等[23]报道了苹果PPO对邻苯二酚催化活力最高，这和本试验结果一致。Liu等[5]报道以邻苯二酚为底物时，桃sPPO的酶活力高于mPPO，这和本试验结果差异较大，这表明sPPO和mPPO对不同底物的亲和力不同。刘芳[19]的研究表明，不同的底物具有单酚、双酚、多酚等不同的结构，同时甲基（-CH3）的数量和位置对底物特异性的决定性具有重大影响。因此，马铃薯sPPO和mPPO与某一底物间的亲和力与自身同工酶构成及底物结构有关。

图4 马铃薯sPPO和mPPO粗酶在不同底物下的酶活力Fig.4 Enzymatic activities of sPPO and mPPO on different kinds of substrates

2.5 黑美人马铃薯PPO粗酶动力学常数

分别以邻苯二酚、焦性没食子酸为底物，以双倒数作图法测定黑美人马铃薯sPPO和mPPO粗酶的动力学常数。如表1所示，以邻苯二酚为底物时，sPPO粗酶Km值为39.423 mmol/L，Vmax为0.019 mmol·L-1·min-1，mPPO粗酶Km值为35.291 mmol/L，Vmax为0.290 mmol·L-1·min-1；以焦性没食子酸为底物时，sPPO的Km值为205.896 mmol/L，Vmax为0.008 mmol·L-1·min-1，mPPO的Km值为205.067 mmol/L，Vmax为22.321 mmol·L-1·min-1。说明sPPO和mPPO存在较大的底物亲和性差异。结果表明，sPPO对邻苯二酚的亲和性和最大反应速度均大于焦性没食子酸；而与焦性没食子酸相比，mPPO的亲和性和最大反应速呈现相反趋势。这表明sPPO和mPPO对底物具有不同选择性，而这种差异可能会影响马铃薯褐变过程。

表1 黑美人马铃薯sPPO和mPPO动力学常数Table 1 Kinetic constants of sPPO and mPPO from black beauty potatoes

2.6 抑制剂对黑美人马铃薯PPO粗酶活力的影响

由图5可知，抗坏血酸和亚硫酸钠对sPPO和mPPO的酶活力抑制作用最强，其中，sPPO均已检测不到酶活力，而mPPO的相对酶活力分别为0.84%±0.36%和1.46%±0.18%。张洪等[20]报道100 mg/kg亚

图5 不同抑制剂对马铃薯sPPO和mPPO粗酶活力的影响Fig.5 Effects of different inhibitors on sPPO and mPPO activities in potatoes

?硫酸钠、150 mg/kg抗坏血酸能有效地抑制PPO的活力，这和本试验结果一致。此外，植酸、草酸、柠檬酸和EDTA显示出对sPPO和mPPO酶活力不同程度的抑制，其中，草酸对mPPO酶活力抑制较强，相对酶活力为61.96%±1.10%；而柠檬酸对sPPO酶活力抑制较强，相对酶活为81.49%±0.30%。Liu等[3]报道，柠檬酸对红富士苹果sPPO的半数抑制浓度（IC50）为90.0 mmol/L，大于植酸和EDTA，这和本试验结果一致；但是，EDTA会激活红富士苹果mPPO的酶活力，这和本试验结果正好相反。各金属离子对sPPO和mPPO酶活力的影响不一，其中Na+、K+和Mg2+对sPPO和mPPO酶活力影响不大，Mn2+、Ca2+和Cu2+可显著抑制sPPO和mPPO的酶活力，且对mPPO的影响要大于sPPO，这可能是由于不同PPO同工酶的蛋白质结构不同，使得各抑制剂的作用效果存在差异[21,24]。

2.7 黑美人马铃薯PPO粗酶的热稳定性

由图5可知，随着温度升高PPO粗酶酶活力逐渐降低，sPPO和mPPO在60℃时失活最明显。但在相同温度下，mPPO比sPPO更容易丧失酶活力。有研究报道，梨[5]和苹果[3]的mPPO均比sPPO的温度稳定性低，这和本试验结果一致。研究表明，苹果mPPO在转运至叶绿体中后，叶绿体基质中多肽酶会将mPPO中的一段小肽切除，从而形成成熟的sPPO，因而mPPO是sPPO的不成熟前体[21]。这可能是马铃薯mPPO和sPPO热稳定性存在差异的原因之一，但需要更多的证据支持。

图6 马铃薯sPPO和mPPO粗酶热稳定性Fig.6 Thermostability of sPPO and mPPO in potatoes

3 结论

本文对黑美人马铃薯sPPO和mPPO酶学性质进行了研究。结果表明：黑美人马铃薯sPPO和mPPO的最佳吸收波长分别是403 nm和406 nm。和其他品种的马铃薯PPO相比，黑美人马铃薯sPPO和mPPO粗酶的最适反应pH值和最适反应温度差异均较大。sPPO和mPPO在酸性条件下酶活力均较低，和sPPO相比，在试验pH值和温度条件下，mPPO的绝对酶活力均高于sPPO；抗坏血酸和亚硫酸钠对PPO的酶活力抑制作用较强，且对sPPO的抑制作用要大于mPPO。因此，在黑美人马铃薯加工过程中，要重点考虑mPPO对酶促褐变的影响。