噻虫胺在黄瓜叶片中累积量与对温室白粉虱防治效果的相关性及残留消解动态

李清华, 张奇珍, 余曼丽, 尹明明, 李文明*,, 陈福良*,

(1. 河南农业大学 植物保护学院，郑州 450000；2. 中国农业科学院 植物保护研究所 农业农村部作物有害生物综合治理重点实验室，北京 100193)

温室白粉虱Trialeurodes vaporariorumWestwood，属同翅目粉虱科，具有寄主范围广、繁殖能力强、传播快、为害重及防治难度大等特点。其寄主植物种类繁多，主要为害瓜类、豆科及茄科等作物。黄瓜作为其寄主之一，温室白粉虱喜食黄瓜嫩叶背面汁液，主要从韧皮部吸食植物汁液，从而造成植株叶面发黄，影响光合作用，阻碍植物生长，与此同时大量分泌蜜露，污染叶片表面，传播煤污病等真菌病害及病毒病[1-3]。黄瓜受害后会出现褪绿、变黄、萎蔫等现象，严重时导致叶片干枯，甚至植株死亡，严重影响品质与产量[4-5]。目前，对白粉虱的防治主要以化学药剂为主，常用的化学药剂有拟除虫菊酯类、有机磷类和新烟碱类农药[6-7]，长期使用拟除虫菊酯类及有机磷类农药，导致白粉虱产生抗性，难以防治。因此，亟须寻找高效替代药剂。

噻虫胺 (clothianidin，图式1) 作为高效安全、高选择性的新烟碱类杀虫剂，其靶向作用于烟碱型乙酰胆碱受体，具有高效、广谱、低毒及使用安全等优点[8-9]，因其具有卓越的内吸活性，故对温室白粉虱等刺吸式口器害虫有良好的防效[10]。噻虫胺已登记的常规剂型有：可湿性粉剂、水分散粒剂和悬浮剂等[11]，这些常规剂型施药方式大多为茎叶喷雾，与包埋颗粒剂相比，存在降解速率快、防效低及持效期短等问题，需加大用药量或多次用药才能达到理想的防治效果，从而增加了对作物与环境的毒性风险，不利于农业的可持续发展。

与常规颗粒剂相比，包埋颗粒剂以具有缓释作用的低熔点高分子聚合物为载体，在加热条件下，使农药有效成分在熔融态载体中熔解并完全被载体包埋，得以缓慢释放，因此具有较长的持效期[12-13]。18%噻虫胺包埋颗粒剂以巴西棕榈蜡和聚乙二醇8 000 为载体，通过将农药有效成分与熔融态载体均匀混合，再经过冷却、粉碎、过筛等工艺制备而成，其载体属于可生物降解的高分子聚合物[14-15]，农药有效成分随着载体的降解缓慢释放，并在环境中逐渐降解消失，对环境友好，符合可持续发展理念[16]。

关于噻虫胺残留的检测方法主要有液相色谱法 (LC)[17]、高效液相色谱法 (HPLC)[18-19]、液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)[20-21]、高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS)[22-23]及超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS)[24]等，检测作物有卷心菜、柑橘、苹果及韭菜等[25-28]。但尚未见有关黄瓜叶片和土壤中噻虫胺残留检测方法的文献报道，因此本研究建立了黄瓜叶片和土壤中噻虫胺残留的超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)检测方法。通过温室黄瓜栽培试验，以1%噻虫胺颗粒剂为对照药剂，研究了18%噻虫胺包埋颗粒剂在不同施药量及黄瓜不同生长期条件下，噻虫胺在土壤中的残留消解动态及不同部位叶片中噻虫胺累积分布情况。进一步探究了黄瓜叶片中的噻虫胺累积量和对温室白粉虱防效之间关系，以期为指导其科学施用，降低环境风险提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 99.0%噻虫胺 (clothianidin) 标准品，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；供试黄瓜Cucumis sativusL. 品种为‘寿禾中寿35’ (密刺型)，寿光欣欣然园艺有限公司；18%噻虫胺包埋颗粒剂 (18%clothianidin embedding GR)，中国农业科学院植物保护研究所研制；1%噻虫胺颗粒剂 (1% clothianidin GR)，河南省孟州市孟州云大高科生物科技有限公司；色谱纯甲酸、N-丙基乙二胺 (PSA) 和十八烷基键合硅胶 (C18)，美国Sigma Aldrich 公司；色谱纯乙腈，美国Fisher 公司；试验用水均为超纯水。

1.1.2 主要仪器设备 XevoTM TQ-S 超高效液相色谱-串联质谱仪 (UPLC-MS/MS)，美国Waters 公司；BSA224S-CW 电子天平，德国Sartorius 公司；QL-901 涡旋混合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore公司；0.22 μm 有机系滤膜，天津市科亿隆实验设备有限公司；2 mL 注射器，江苏治宇医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验地概况 试验地点设在北京市海淀区中国农业科学院植物保护研究所温室，于2019 年6—8 月在温室开展预试验，正式试验于2020 年8—10 月进行，试验地土质为壤土，肥力较高，pH 7.2，试验期间栽培和管理条件良好，肥水管理适中。

1.2.2 试验设计 参照 《田间药效试验准则 (一)杀虫剂防治温室白粉虱》[29]中关于温室白粉虱田间药效试验，并严格按照以上准则进行。在黄瓜播种的同时，进行药剂拌土撒施。施药剂量 (有效成分)：18% 噻虫胺包埋颗粒剂450 g/hm2(处理1)、600 g/hm2(处理2)、750 g/hm2(处理3)；对照药剂1%噻虫胺颗粒剂450 g/hm2(CK1)，空白对照 (CK2)。共5 个处理，试验小区采用随机区组排列，每处理3 次重复，每重复10 株黄瓜。试验期间未喷施其他药剂，所有处理水肥管理一致。

1.2.3 田间防效调查 调查白粉虱虫口数之前，观察各处理小区黄瓜植株生长情况及有无药害现象产生。调查时间分别为施药后21、28、35、42、49、56 和63 d，共调查7 次。由于本试验是种植黄瓜的同时采取土壤施药的方式，而温室白粉虱是自然发生，因此以施药后21 d，即温室白粉虱形成一定种群数量时的虫口数作为虫口基数。在早晨白粉虱不活跃的情况下，采取五点取样法定点定株调查，每点调查2 株，每株黄瓜分别调查上部和中部各3 片叶，上部叶片为从黄瓜植株根部往上数第9～11 片叶，中部叶片为从根部往上数第3～5 片叶。记录叶片正背面所有白粉虱活虫虫口数。分别按照公式 (1) 和 (2) 计算虫口减退率与校正防效。

式中：P表示虫口减退率，%；N0表示施药前虫口数 (施药后21 d 虫口数)；Nt表示施药后虫口数。C表示校正防效，%；Pt表示处理区虫口减退率，%；P0表示空白对照区虫口减退率，%。

1.2.4 样品采集 采用五点取样法取样。

土壤样品：分别于施药后2 h 及1、3、7、14、21、28、35、42、49、56、63 d 采集土壤样品，过筛，冷冻干燥后四分法缩分留样250 g，于-20 ℃保存，待测。

黄瓜叶片样品：黄瓜叶片样品采集与白粉虱虫口数调查同期进行，共采集7 次，叶片样品经粉碎匀浆后四分法缩分留样100 g，于 -20 ℃保存，待测[30]。

1.2.5 样品前处理 称取土壤样品10.00 g (黄瓜叶片样品5.00 g) 于50 mL 离心管中，依次加入5 mL 超纯水 (黄瓜叶片不加水) 和10 mL 乙腈，振荡10 min，加入1.00 g NaCl 和4.00 g 无水MgSO4，振荡5 min，于4 000 r/min 下离心5 min；取1.5 mL上清液于2 mL 净化管 (净化剂为0.05 g PSA、0.05 g C18和0.15 g 无水MgSO4) 中，涡旋2 min，于8 000 r/min 下离心5 min；取上清液，过0.22 μm 滤膜至2 mL 进样瓶，待测。

1.3 仪器检测条件

色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)，Waters 公司，柱温35 ℃。流动相为乙腈 (A) 和0.2% 甲酸水溶液(B)，流速0.28 mL/min，进样量3 μL。流动相梯度洗脱程序：0 min，10%A；＞0～1.0 min，10%A～90%A；＞1.0～1.5 min，90%A；＞1.5～2.0 min，90%A～10%A；＞2.0～2.5 min，10%A。

质谱条件：ESI 正离子源模式电离，多反应监测模式 (MRM)，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压52 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度300 ℃，脱溶剂气流量500 L/h，锥孔气流量50 L/h。噻虫胺在MRM 下的质谱采集参数及质谱条件：定性离子对131.90/249.90，定量离子对169.00/249.90。图1 为质量浓度为0.1 mg/L 噻虫胺乙腈标准溶液色谱图，在上述色谱条件下，噻虫胺的相对保留时间为1.37 min。

1.4 标准溶液配制及标准曲线绘制

称取0.05 g 噻虫胺标准品 (精确至0.000 1 g)于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配成1 000 mg/L标准储备溶液，于4 ℃保存。分别用乙腈梯度稀释噻虫胺标准储备液，配成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 和2 mg/L 的系列噻虫胺标准溶液。用空白基质提取液稀释，配成同等浓度梯度的噻虫胺基质匹配标准溶液，于4 ℃保存。按1.3 节的条件测定，以噻虫胺标准溶液质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 基质效应

基质效应 (Me) 是指检测样品中除分析物以外的组分对分析物分析结果的准确性造成的影响与干扰，用基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值表征。当Me值小于0.9 时为基质减弱效应；当Me值大于1.1 时为基质增强效应；当Me值介于0.9～1.1 时基质效应可以忽略[31]。

1.6 添加回收试验

分别向空白黄瓜叶片样品和空白土壤样品中添加0.01、0.1、1 和5 mg/kg 4 个水平的噻虫胺标准溶液，每个水平重复5 次，静置2 h 后，按照1.2.5 节步骤处理样品，1.3 节的条件检测，计算添加回收率及相对标准偏差。

1.7 数据处理

采用SPSS 20.0 软件和Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验 (P＜ 0.05)。

2 结果与分析

2.1 方法的线性关系、灵敏度与基质效应

在0.002～2.00 mg/L 范围内，噻虫胺标准溶液线性方程为y= 1 138 971x+ 22 190，相关系数r=0.999 1；噻虫胺黄瓜叶片基质匹配标准溶液线性方程为y= 972168x + 44 449，r= 0.999 9；噻虫胺土壤基质匹配标准溶液线性方程为y= 1 277 158x+103 215，r= 0.998 8。其中，Me(黄瓜叶片) = 0.85，Me(土壤) = 1.12，二者均存在微弱的基质效应，故需引入基质匹配标准曲线进行定量分析。以方法的最低检测浓度为定量限 (LOQ)，则LOQ 为0.002 mg/L。

2.2 方法的准确度与精密度

结果 (表1) 表明：在0.01～5 mg/kg 4 个添加水平下，噻虫胺在黄瓜叶片中平均回收率为95%～96%，相对标准偏差 (RSD) 为0.90%～4.3%；在土壤中平均添加回收率为91%～108%，RSD 为1.3%～4.4%。方法回收率与精密度良好，简单可行，可满足农药残留检测分析的要求[32]。

表1 噻虫胺在黄瓜叶片和土壤中的添加回收率与相对标准偏差 (n = 5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of clothianidin in cucumber leaves and soil (n = 5)

2.3 噻虫胺在土壤中的残留消解动态

由表2 可知：噻虫胺在土壤中的消解动态符合一级反应动力学方程。噻虫胺在土壤中的原始沉积量和消解半衰期与施药剂量呈正相关；同等施药剂量下，18%噻虫胺包埋颗粒剂在土壤中的消解速率较对照药剂缓慢，消解半衰期延长8 d。

表2 噻虫胺在土壤中的残留量与消解动态Table 2 Residues and dissipation dynamic of clothianidin in soil

2.4 噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量

结果 (图2) 表明：噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量与施药剂量呈正相关；随施药时间的推移，噻虫胺在叶片中的累积量呈现先升高后降低的趋势，且在黄瓜中部叶片中的累积量高于上部叶片，并于施药后56 d 达到最大值。在同等施药剂量下，18%噻虫胺包埋颗粒剂中噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量高出对照药剂5%～32%，且在施药后63 d，噻虫胺在叶片中仍有较高的累积量，从而保证了黄瓜生长后期对温室白粉虱的防效。

2.5 噻虫胺对温室白粉虱的防治效果

结果 (表3) 表明：试验期间，噻虫胺对黄瓜中部叶片温室白粉虱的防效高于对上部叶片的，且均在施药后56 d 达到最大值，这与2.4 节中噻虫胺在黄瓜中部叶片累积量高于上部叶片的结果一致。在相同施药剂量下，18%噻虫胺包埋颗粒剂对温室白粉虱的防效显著高于对照药剂1%噻虫胺颗粒剂，防效提高7%～24%；且在施药后63 d，450 g/hm2处理平均防效为89%，而CK1平均防效仅为66%，表明18%噻虫胺包埋颗粒剂对黄瓜温室白粉虱防效高且持效期长。18%噻虫胺包埋颗粒剂450、600 和750 g/hm23 个施药剂量之间的防效显著性分析结果为：施药后28～42 d，处理间防效差异显著；施药后49～63 d，3 个处理间防效相当，无显著性差异。其中，在调查温室白粉虱虫口数前期，18%噻虫胺包埋颗粒剂对温室白粉虱的防效表现为低剂量处理高于高剂量，其原因可能是本试验中的施药剂量是以大田条件下的推荐施药剂量为参考，而温室环境不同于大田，不同环境条件下噻虫胺的消解速率存在显著差异，而当黄瓜叶片中的噻虫胺累积量达到一定量时，很难突破防效阈值，导致试验后期3 个施药剂量之间防效差异不显著。

表3 噻虫胺对温室白粉虱的防治效果 (n = 5)Table 3 Control efficacy of clothianidin on greenhouse whitefly (n = 5)

2.6 噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量与对温室白粉虱防效的相关性分析

以18%噻虫胺包埋颗粒剂有效成分450 g/hm2(处理1) 和1%噻虫胺颗粒剂450 g/hm2(CK1) 条件下黄瓜上部叶片为例，进行噻虫胺累积量与防效相关性分析。由图3 可知：噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量与其对温室白粉虱的校正防效均随施药时间的推移呈现先升高后降低的趋势，且均在施药后56 d 达到最大值。在施药后28～63 d，处理1 对温室白粉虱的防效为58%～90%，噻虫胺累积量为1.3～1.9 mg/kg，而CK1防效仅为25%～77%，噻虫胺累积量为1.2～1.8 mg/kg。在同等施药剂量条件下，与CK1相比，处理1 对温室白粉虱的防效提高13%～33%，黄瓜叶片对噻虫胺的累积量提高0.08～0.30 mg/kg。在施药后63 d，处理1 防效为85%，CK1仅为62%。

由图4 可知：18%噻虫胺包埋颗粒剂施药剂量为有效成分450 g/hm2(处理1) 时，噻虫胺对温室白粉虱的防效随叶片中噻虫胺累积量的增加而增大，其防效与累积量的线性相关方程为y=46.70x+ 3.34，相关系数 (r) = 0.910 5，CK1防效与累积量的线性相关性方程为y= 87.95x-90.91，r=0.959 0。

3 结论与讨论

本研究采用UPLC-MS/MS 建立了噻虫胺黄瓜叶片及土壤中残留的检测方法，检测了噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量与其在土壤中的残留消解动态，并通过温室黄瓜栽培试验，调查了18%噻虫胺包埋颗粒剂对黄瓜温室白粉虱的防效。结果表明：在0.01～5 mg/kg 添加水平下，噻虫胺在黄瓜叶片和土壤中的平均回收率为91%～108%，RSD为0.90%～4.4% (n=5)，方法重复性好，准确度和灵敏度高，可满足对噻虫胺残留检测的要求。噻虫胺在叶片中的累积量及在土壤中的残留量均随施药剂量的增加而增加；随施药时间的推移，噻虫胺在叶片中的累积量呈现先升高后降低的趋势，噻虫胺在土壤中的残留消解动态符合一级反应动力学方程。18%噻虫胺包埋颗粒剂在土壤中的消解半衰期为43～63 d，对照药剂1%噻虫胺颗粒剂在土壤中的消解半衰期为35 d。18%噻虫胺包埋颗粒剂各施药剂量处理下，对黄瓜温室白粉虱均表现出良好的防效，其中以450 g a.i./hm2施药剂量处理黄瓜时的防效最优。噻虫胺在叶片中的累积量与其对温室白粉虱防效变化趋势一致，且均在施药后56 d 达到最高值。

本研究中，18%噻虫胺包埋颗粒剂在土壤中的消解半衰期为43～63 d。土壤中的农药降解速率与作物生长环境、施药方式及土壤类型等多种因素有关[33]。管欢等[34]报道，噻虫胺在土壤中的消解半衰期为24.3～26.4 d；杨庆喜等[35]研究报道，噻虫胺在土壤中的消解半衰期为6.5～27.7 d，本研究结果与之存在显著差异，其原因可能是：在温室条件下，由于植株生长空间较为封闭，受自然条件如雨水冲击、阳光直射等影响较小，因此土壤中的农药降解速率较慢[36-37]。不同土壤类型也会造成农药在土壤中消解速率不同。张鹏等[38]研究发现，噻虫胺在北京、贵州和山东土壤中的消解半衰期分别为9.4～21 d、18.7 d 和11.6～15.8 d，噻虫胺在不同试验地点土壤中消解半衰期存在差异，其原因可能是土壤中的微生物含量、有机质含量、酸碱度、含水量等不同。

随施药时间的推移，噻虫胺在黄瓜叶片中的累积量呈现先升高后降低的趋势，这与韩毅等[39]对吡虫啉在烟草植株中吸收传导分布规律的研究结果相似，即在作物根部施药条件下，烟草叶片中吡虫啉在施药后7 d 达到最高含量，随后开始下降。噻虫胺在黄瓜中部叶片中的累积量高于上部叶片，其原因可能是噻虫胺具有强内吸活性，通过植株根部吸收、传导并运输至叶片部位，中部叶片对噻虫胺的累积时间较上部叶片长，因此中部叶片对噻虫胺的累积量高于上部叶片。

本研究结果表明，当18%噻虫胺包埋颗粒剂施药剂量为有效成分450 g/hm2时，即可对温室白粉虱达到理想的防治效果。黄瓜叶片对噻虫胺的累积量与对温室白粉虱防效之间具有良好的相关性，与1%噻虫胺颗粒剂相比，18%噻虫胺包埋颗粒剂处理的黄瓜叶片中噻虫胺累积量较高，且对温室白粉虱具有较高防效；18%噻虫胺包埋颗粒剂在土壤中的消解半衰期明显高于对照药剂，消解速率缓慢，施药后63 d 对温室白粉虱防效仍保持在较高水平，表明其对温室白粉虱的防治具有较好的持效性。18%噻虫胺包埋颗粒剂用于农业生产中防治有害生物时，其农药有效成分释放速率缓慢，可大幅延长对有害生物防治的持效期，不仅能够有效地提高农药利用率，而且减少了农业生产中劳动力与财力投入成本，因此具有重要的应用价值和农业生产指导意义。