小麦蛋白双酶酶解制备高抗氧化性小麦肽研究

刘世欣 冯军伟 董得平 王晓飞 尚海

摘要：为了能成功制备出抗氧化性更高的小麦肽，本课题应用分布酶解方法，基于响应面法完善择碱性及风味蛋白酶两种酶的最佳酶解工艺参数，超滤技术分级分离最后获得的酶解物。最后所得的酶解物自由基DPPH、O2-、·OH清除率分别75.37%、74.52%、76.28%。综合分析，认为小麦蛋白酶解物自身的抗氧化活性处于较高水平。

关键词：小麦蛋白;双酶酶解;小麦肽;抗氧化性

引言

有研究发现，小麦蛋白的蛋白质含量达到75%-85%，麦醇溶蛋白、麦谷蛋白是其主要成分。因为小麦蛋白自身特殊的结构与氨基酸构成，造成分子内疏水区偏大，以致其在水内的溶解性整体偏差。为全面提升其加工与功能属性，既往多采用物理法、化学法及酶解法进行。相比之下，蛋白质酶解改性反应过程平稳、效率高、便于控制、产物可靠性较高。小麦肽作为酶解的主要产物之一，抗氧化性是其主要的功能属性，自由基DPPH、O2-、·OH清除情况等均是反应抗氧化性的常用指标，本课题应用了分步酶解方法，研究酶解制备小麦肽的抗氧化性。

1. 概念分析

1.1 小麦蛋白

蛋白质占小麦总量的13%左右，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白等构成，其中清蛋白主要存在于胚内，其溶于水于稀盐溶液，热稳定性偏低，温度达60℃时可变性。球蛋白在小麦蛋白总量中占比6%-10%，溶于10%NaCI，但和水不相溶。麦醇溶谷蛋白占比约40%-50%，为小麦作物的主要蛋白，和水及中性盐溶液均，但溶70%-90%乙醇。

1.2 小麦肽

这是一种始源于小麦蛋白的植物性生物活性肽，内含人体必需的15种氨基酸，其具有水溶性好、容易吸收、生物活性强等诸多特点。既往已经有研究证实，人体摄入的蛋白质被自体消化系统内的酶作用后，绝非是以氨基酸的形式被吸收，吸收形式以低肽为主。

2. 操作方法

（1）分步酶解：把100g小麦蛋白与定量去离子水相混合，放置在水浴锅内保温，1.0mol/L NaOH将容易调整至设计pH值，随后加入适量酶进行酶解，以上过程中每间隔20min就调整1次pH值，使其维持恒定;充分搅拌酶解，酶解整体完成后，沸水持续灭酶10min，调整温度与pH至到风味蛋白酶的最适条件（温度50℃、pH6.5）;添加定量风味蛋白酶进行第2步酶解，pH调整、搅拌、灭酶操作同第1步;自然冷却后2800r/min离心处理20min，提取上清液充分冷冻干燥，低温（-20℃）环境下保存以备用。

（2）检测自由基清除率：具体是参考HALLIWELL等研究中形成的方法测定1，1一二苯基一2一三硝基苯肼（DPPH）、超氧阴离（O2-、）、羟自由基（·OH）的清除率。

（3）设计响应面试验：①碱性蛋白酶：选出影响自由基清除率的主要因素，有底物浓度X1、酶浓度X2、反应时间X3作为自变量;DPPH、O2-、·OH清除率（Y1、Y2、Y3）作为因变量。Rox-Behnken开展响应面的优化试验。②风味蛋白酶：酶浓度X1、反应时间X2是影响自由基清除率的主要因素，将其作为自变量;自由基清除率Y1、Y2、Y3作为因变量，在专业软件的协助下开展响应面优化试验。

超滤分级分离：应用截留分子量依次是5000、3000、10000u超滤膜分别对小麦混合肽进行分级分离处理，获得I、II、III、IV组分，均进行冷冻干燥处理以备用。用以上四组分与混合肽试样配制3mg/mL，测定DPPH、O2-、·OH清除率。

3. 统计与分析结果

3.1 碱性蛋白酶

3.1.1 酶解结果

当底物质量分数<10%时，伴随底物质量分数的增加，蛋白酶解物的DPPH、O2-、·OH清除率均呈提高趋势;质量分数恰好是10%时，以上三种自由基的清除能力均达到峰值，依次是56.32%、55.68%、58.45%;质量分数>10%时，三种自由基的清除能力均呈下滑趋势。当添加的酶和底物充分反应后，再增加底物浓度使其处于饱和状态，对底物与酶两者的反应起到一定抑制作用。综合认为，底物质量分数是10%时，碱性蛋白酶的自由基清除能力达到最佳。

酶含量<2000U/g时，3种自由基清除能力高低和酶浓度大小之间呈正比关系;酶含量是2000U/g时，，各自由基清除能力均达到峰值;>2000U/g，各自由基清除能力均稳定降低。酶添加量过多，容易造成酶之间形成较强的竞争关系，对蛋白酶解过程会形成一定抑制作用。结合本试验结果，酶含量是2000U/g时，蛋白酶解物清除自由基的能力最佳。

伴随酶解时间的延长，三种自由基的清除能力均有提高，持续酶解4h后自由基的清除能力趋于稳定且稍降低。4h内反应快速，小麦蛋白和酶结合成分，生成大量的小麦多肽，这是提升自由基清除率的重要基础。反应时间过长不仅容易造成小麦多肽过早氧化，也可能提高生产成本，选择酶解的最佳酶解时间4h。

3.1.2 酶解响应面试验

回归拟合试验所得数据，获得响应面回归方程。分析回归方差发现，基于实验各指标建设的二次回归模型之间形成了显著差异（P<0.01），各Y1、Y2、Y3响应值的失拟项依次是0.437、0.144、0.183，都在0.05以上，提示模型和实际数据拟合较好，回归方程位失拟。利用变异系数（CV）表示实验自身的精准性，本试验各响应值的CV值依次为4.06%、4.86%、3.77%，CV值偏小，代表试验的可靠性较高。通过分析发现，酶浓度对以上三种自由基清除效果形成的影响最大。当酶浓度恒定时，伴随底物浓度的增加，各自由基清除率均表现出先升后降的变化趋势，但下降趋势并不显著。观察等高线图，底物质量分数11-12%，酶含量2000-300U/g，优化三种自由基清除率能得到峰值。

第1步酶解最佳工艺参数：底物内碱性蛋白酶的含量11.3%，酶含量、pH对应值分别是2210U/g、8.4，55℃温度条件下持续酶解4.4h;预估DPPH、O2-、·OH清除率分别为60.26%、58.85%、60.06%。

3.2 风味蛋白酶

3.2.1酶解试验结果

风味蛋白酶添加量1000U/g时，对自由基清除效果最佳，此时测得DPPH、O2-、·OH清除率依次是71.23%、68.32%、72.07%。酶解适宜时间2h，以上三种自由基清除率76.58%、74.12%、77.86%。

3.2.2响应面试验

结合方差计算结果，利用各指标建设的二次回归模型，其间存在十分显著的差异（P<0.01），各响应值的失拟项均>0.05，提示本模型和实际数据之间形成了良好的拟合关系，可采用该回归方程分析试验结果。校正系数依次是0.898，、0.944、0.932，提示运用该模式能依次解释89.8%、94.4%、93.2%的响应值改变。本试验各响应值的变异系数（CV）分别是3.1%、1.98%、2.51%，CV值较低，提示试验可靠性较高。可采用这种模型分析与预测小麦蛋白酶解第2步，Design-Expert V8.0.6软件模拟优化回归方程，得出最佳工艺参数：pH、温度分别为1075U/g、6.6、50℃时酶解处理风味蛋白酶2.3h，自由基DPPH、O2-、·OH清除率分别75.37%、74.52%、76.28%。

结束语

应用碱性及风味蛋白酶分步酶解法酶解处理小麦蛋白，能成功制备出高抗氧化性小麦肽，分别获得第1、2步最佳工艺参数，最后测得自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。

作者简介：

刘世欣（1988.4-），女，河南安阳人，本科，研究方向：淀粉糖品控。