基于分子对接虚拟筛选PBP2a蛋白蒲公英活性成分抗菌剂

刘 旭， 吕小刚， 梁引库,2*， 穆阿宁

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000； 2.陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

青霉素结合蛋白(PBPs)在细菌细胞壁的形成过程中起着关键作用。β-内酰胺类抗生素可以结合PBPs，从而影响细胞壁肽聚糖的生物合成，起到杀菌作用。其作用机制为抗生素与PBPs可形成共价酰基酶复合物，它抑制了细胞壁转肽而使脱酰化反应受阻来杀死细菌[1]。但耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)作为典型的耐药菌，其产生的PBP2a作为一种较为特殊的青霉素结合蛋白，与抗生素亲和力很低从而导致广谱耐药一直威胁着人类的安全[2]。作为治疗MRSA感染的有效药物万古霉素及相对新型药物利奈唑胺和达托霉素已经不足以满足当前需求，开发一种新型抗耐药类药物迫在眉睫。而中药具有广谱抗菌作用，表现出多组分多途径的作用功效，是现今逐渐被认可的有效抗菌药物。从中药中寻找一种或几种天然活性物质直接作用于细菌表面或协同抗生素增加MRSA对药物敏感性为近年来的研究热点。由于传统实验筛选新药周期长，为减少药物筛选的盲目性，提高研发效率，采用分子对接技术虚拟筛选得到与靶蛋白紧密结合的候选化合物，从而提高新药研究的成功率。谷宇等[3]利用分子对接技术靶向筛选大黄、羌活和秦艽几味中药抗炎活性成分，得到了12个天然抗炎活性抑制剂；周月等[4]同样利用分子对接技术筛选出了23个打分高于阳性药物的菊苣活性成分。作为筛选中药药效物质的一种手段，分子对接在一定程度上可以阐明蛋白与小分子配体的相互作用机制。

蒲公英具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[5-10]，是一种常用的清热解毒、抗菌消炎中药。本研究采用分子对接技术将蒲公英活性成分与MRSA耐药相关的PBP2a蛋白进行虚拟筛选，以期得到能有效结合PBP2a的蒲公英活性物质，同时阐明PBP2a蛋白与小分子的作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

PDB数据库(https://www.rcsb.org/)，PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

软件：Auto Dock Tools 1.5.6，Auto Dock Vina[11]，PyMol，Discovery Studio2019(DS)，Chem Draw 2017，Chem 3D。

1.2 分子对接模拟

(1)PBP2a蛋白结构准备：由于PBP2a蛋白已被解析，我们从蛋白结构数据库PDB中下载PBP2a蛋白的晶体结构作为初始结构，蛋白编号为5M19[12]，基源为金黄色葡萄球菌，并用DS软件进行预处理，该蛋白为两条相同的链，去除其中一条链，包括去除水分子，添加极性氢原子，计算点电荷，添加原子类型等[13]，处理后的蛋白结构如图1(a)所示。

(2)结合口袋确认：由于该蛋白为PBP2a与苯唑西林的复合物，苯唑西林与PBP2a催化区域附近的氨基酸形成氢键，利用DS软件以原配体作为参考来确认结合位点。提取原配体苯唑西林，与处理过的蛋白进行对接，将此时配体位点坐标设置为活性中心(如图1(b)所示)，参数为x=-20.644 529，y=-17.791 824，z=51.806 000，size=35，其余均为默认值。原配体苯唑西林对接后构象与未对接原配体结构相比，RMSD值≤0.2 nm，说明此对接方法较为准确，具有可行性且对接参数设置合理[14]。

(a)预处理结构图 (b)PBP2a蛋白结合口袋 图1 PBP2a蛋白及与苯唑西林结合结构图

(3)蒲公英活性成分结构准备：蒲公英活性成分初始结构用Chem Draw画出小分子结构，并分别用Chem Draw进行能量最小化并存储转化为mol2格式，再利用Autodock tools将小分子转化为pdbqt格式。

(4)分子对接：分子对接采用半柔性对接法，对PBP2a蛋白进行刚性处理，固定其构象，确定活性分子的可旋转键使其可进行自由转动。将处理好的蛋白与小分子化合物使用Vina软件进行对接，将蒲公英中小分子化合物能量低于原配体苯唑西林的作为候选化合物，并采用结合自由能最低的构象作为最佳结果，其中靶点亲和力排名前10%的认定为阳性结果，最后利用DS软件得到对接结果及图像并做最后的分析。

2 结果与分析

2.1 PBP2a蛋白与蒲公英小分子结合分析

使用Autodock vina软件获得63个蒲公英活性分子与PBP2a相互作用的结合能，以及对接氨基酸残基，具体见表1。其中包括原配体苯唑西林，原配体氢键作用的氨基酸残基为THR165，可以看出在对接的63个复合物构象中，前57个结合能量均低于原配体苯唑西林，结合最为稳定的蒲公英活性物质为蒲公英甾醇、异绿原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇、齐墩果酸。这表明蒲公英甾醇、异绿原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇以及齐墩果酸可能为PBP2a蛋白的配体物质。依据结合能量最低原理筛选出前5个作为对接最佳活性分子进行下一步研究。

表1 PBP2a蛋白与蒲公英活性物质分子对接结果

续表

注：“—”表示与PBP2a无氢键相互作用。

2.2 蒲公英甾醇与PBP2a蛋白的分子对接结果分析

用DS软件分析蒲公英甾醇与PBP2a蛋白的对接结果，二者主要形成疏水间作用力。其结合自由能为-9.9 kcal/mol。蒲公英甾醇与PBP2a蛋白作用的氨基酸残基为TYR373、PRO258、VAL277、ARG151、ARG241(图2)。

(a)3D图

(b)2D图图2 蒲公英甾醇与PBP2a蛋白相互作用图

2.3 异绿原酸A与PBP2a蛋白的分子对接结果分析

用DS软件分析蒲公英异绿原酸A与PBP2a蛋白的对接，结果发现异绿原酸A与PBP2a蛋白作用的氨基酸残基为THR165、ARG151、ASP295、GLN292、GLU294、ARG241、TYR272，主要通过氢键和疏水键相互作用，其中异绿原酸A与THR165、ARG151、ASP295、GLN292、GLU294形成氢键外，还能与TYR272形成π-π堆积作用(图3)，其总的结合能量为-9.7 kcal/mol。另外原配体苯唑西林与THR165也存在着氢键相互作用，这意味着THR165作为一个关键氨基酸残基与PBP2a蛋白结合。

(a)3D图

(b)2D图图3 异绿原酸A与PBP2a蛋白相互作用图

2.4 款冬二醇与PBP2a蛋白的分子对接结果分析

同上，款冬二醇与PBP2a蛋白作用的氨基酸残基为MET372、PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241，其中款冬二醇与PBP2a蛋白以氢键形式作用，形成氢键的氨基酸残基为MET372，其余均为疏水间相互作用力(图4)。其结合总能量为-9.7 kcal/mol。

(a)3D图

(b)2D图图4 款冬二醇与PBP2a蛋白相互作用图

2.5 羽扇豆醇与PBP2a蛋白的分子对接结果分析

羽扇豆醇与PBP2a蛋白作用的氨基酸残基为ARG151、VAL256、ARG241、VAL277、PRO258，虽然根据能量最低原则视其结合构象较为稳定，能量为-9.6 kcal/mol，但其作用力均为疏水间相互作用力，而没有以作用力更强的氢键作用(图5)。

2.6 齐墩果酸与PBP2a蛋白的分子对接结果分析

用DS软件分析齐墩果酸与PBP2a蛋白的对接，结果发现齐墩果酸与PBP2a蛋白作用的氨基酸残基为THR216、PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241，主要通过氢键和疏水键相互作用，齐墩果酸与THR216通过氢键相互作用，PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241残基与齐墩果酸形成疏水作用。其结合总能量为-9.3 kcal/mol(图6)。

(a)3D图

(b)2D图图5 羽扇豆醇与PBP2a蛋白相互作用图

3 结果与讨论

青霉素结合蛋白PBP2a对细胞膜具有修复作用，其活性可降低一些破坏膜类抗生素的抑菌效果。主要原因是PBP2a蛋白活性位点SER位于狭窄的延伸处，不易与β-内酰胺类抗生素结合[15]，进而起到抗菌作用。因此发现一种能有效与PBP2a蛋白结合，降低PBP2a蛋白膜修复活性，就能有效协同β-内酰胺类抗生素发挥抗菌作用，达到治疗的目的。

(a)3D图

(b)2D图图6 齐墩果酸与PBP2a蛋白相互作用图

分子对接虚拟筛选结果表明，多数蒲公英活性物质与PBP2a是通过氢键和范德华力作用。根据结合稳定性原理，本文分别研究了57个蒲公英活性成分与PBP2a结合及结合稳定性，根据结合能量筛选出5个能与PBP2a稳定结合的蒲公英小分子，即蒲公英甾醇、异绿原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇和齐墩果酸。进一步分析发现蒲公英甾醇、异绿原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇、齐墩果酸这5种物质都与ARG151、ARG241氨基酸残基形成氢键作用。说明ARG可能为潜在的关键氨基酸残基。其中异绿原酸A可以通过破坏细菌细胞壁、增加细胞膜通透性来抑制细菌生长[16]，齐墩果酸也被报道有一定的抑菌作用。有研究表明PBP2a蛋白活性位点为SER403，而MET641和TYR446为活性位点侧链的氨基酸残基[12]，小分子化合物可能无法直接进入活性位点，而可以通过侧链影响其变构位点发生变化，从而使其他小分子有机会结合到活性位点。也有研究表明一些和mecA无关的基因也能导致细菌产生耐药，临床上已发现一种边缘性耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(borderline oxacillin-resistant S.aureus，BORSA)[17-18]，不携带mecA和mecC基因，它对苯唑西林有轻微的耐药性，有研究发现其分离株和野生株会发生突变，从而导致其对抗生素的耐药。因此可基于多组学技术或者多组学联用探究抗生素或中药活性成分与细菌之间的作用机制，有助于从新的角度靶向挖掘新的抗生素佐剂和抗菌剂。

由于原配体作用的氨基酸残基为THR165，齐墩果酸氢键相互作用的氨基酸残基为THR，由此可推测THR可能为PBP2a蛋白的关键氨基酸残基。上述蒲公英活性成分与靶蛋白氨基酸残基具有较好的氢键作用力，可作为MRSA的候选抑制剂。