长链非编码RNA CCAT1在老年非小细胞肺癌患者血浆中的表达及临床意义

宫莉莉 吕 智

厦门大学附属中山医院(福建 厦门 361000)

肺癌在世界范围内发病率较高,是最致命的恶性肿瘤之一,5年生存率约为15%,每年约有160万人死于肺癌[1]。在我国,肺癌发病例数位居癌症发病的首位,每年约78.1万发病,尤其60岁以上老年患者的肺癌发病率更高,严重危害老年患者生命健康[2]。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最为常见的类型,约占所有肺癌病例的80-85%[3]。遗传学和表观遗传学改变导致的癌基因和抑癌基因表达异常与肺癌发生密切相关。研究表明,长链非编码RNA在肺癌的发生发展过程中扮演着重要角色[4]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的转录本长度大于200nt,缺少开放阅读框,无法编码蛋白质,但lncRNA 具有调控基因表达和转录过程,在肿瘤发生、细胞增殖及凋亡等方面发挥作用,可作为肿瘤抑制基因和癌基因发挥作用[5]。结肠癌相关转录因子 1(colon cancer associated transcript 1,CCAT1)首先在结肠癌中被发现,在多种恶性肿瘤中表达升高,且大多与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及预后相关,对肿瘤的诊断及预后判断具有一定的意义[6]。本研究检测老年非小细胞肺癌患者血浆中CCAT1的表达,分析其与患者临床特征的关系,为探讨CCAT1作为早期预测及预后的标志物提供实验基础。

1 方法

1.1对象和分组 选取2018年1月至2020年1月在我院接受手术治疗的老年非小细胞肺癌患者,共纳入30例(NSCLS组,n=30),男性18例,女性12例,年龄60～85岁,平均(70.7±8.17)岁；肿瘤直径:>3cm 11例,≤3cm 19例；TNM分期:Ⅰ期+Ⅱ期16例,Ⅲ期+Ⅳ期14例；出现淋巴结转移10例。纳入标准:(1)临床确诊为NSCLC；(2)原发患者,手术前未进行任何治疗；(3)无其他并发症。30例老年良性肺部疾病患者包括支气管扩张7例,间质性肺炎15例,肺囊肿8例(对照组,n=30),男性16例,女性14例,年龄60～80岁,平均(67.5±6.15)岁,对两组基础资料进行比较,差异无统计学意义。本研究通过医院伦理委员会批准,患者知情同意研究内容并签署知情同意书。

1.2材料和试剂 血清/血浆 microRNA 快速提取试剂盒、血清/血浆microRNA反转录试剂盒和microRNA荧光定量PCR试剂盒购至北京百奥莱博科技股份有限公司。

1.3血浆样品制备及miRNAs提取 患者空腹状态,使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集各组患者外周静脉血5mL,4℃静置1h,3000rpm离心10min,收集上清液置于RNase-free离心管中,应用microRNA快速提取试剂盒,按照试剂盒说明书步骤提取血浆中的microRNA,向1.5mL EP管中加入800μL miRNA Reagent,再加入300μL血浆样本,混匀后室温放置5min,13000rpm离心5min,取上清约1mL吸入到新的2mL EP管中,加入1mL异丙醇,上下颠倒混合均匀。将上述溶液通过吸附柱中,13000rpm离心15s,倒掉过柱液。分别经过异丙醇、无水乙醇洗涤,在吸附柱滤芯上加入30μL RNase-free水,13000rpm离心2min,洗脱产物即为提取的miRNAs。

1.4反转录及实时定量PCR 取RNA样品进行反转录,反转录后取2ul cDNA 进行qRT-PCR检测,反应条件为:95℃预变性 50sec,95℃ 10sec,60℃ 30sec,40个循环,采用 2-△△ct法进行分析lncRNA CCAT1的相对表达量。引物序列如下:

lncRNA CCAT1 F:5′-TTGCTCACCTTACTGCCTGA-3′,

lncRNA CCAT1 R:5′-CTCATAAGGAGCGCACAACC-3′。

GAPDH F:5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,

GAPDH R:5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析,计量资料数据用均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CCAT1在非小细胞肺癌和良性肺部疾病中的表达 应用实时定量PCR方法检测两组患者外周血CCAT1的表达,结果显示,与对照组相比,NSCLC组患者外周血中CCAT1表达增高(P<0.05),见图1。

图1 qRT-PCR检测两组患者血浆中CCAT1的表达

2.2血浆CCAT1表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系 血浆CCAT1表达与NSCLC患者性别、吸烟史、病理类型、组织分化程度、TNM分期无关(P>0.05),与肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移有关(P<0.05),见表1。

表1 血浆CCAT1表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系

3 讨论

肺癌是全球范围内的公共卫生问题,临床表现与原发灶位置和是否发生转移有关,患者早期一般无典型症状,确诊时通常已发展到中晚期。影像学筛查如胸部X线、CT、磁共振以及PET-CT都是临床常用肺癌检测手段,但由于其各自的局限性,都不适用于早期肺癌的筛查,确诊不及时是肺癌高病死率的主要原因之一,我国肺癌患者五年生存率仅为18.7%[7],研究新的肺癌标记物以及提高肺癌早期诊断率对提高其整体生存率至关重要。

近年来,随着分子生物学技术的发展,包括长链非编码RNA(lncRNA)和miRNAs在内的非编码RNA表达失调在肺癌的发生发展过程中发挥重要作用,作为诊断和预后评估的标志物被广泛研究[8]。lncRNA CCAT1定位于人类8q24.21,转录本长度为2628个核苷酸,其编码序列位于原癌基因c-Myc增强子区域,可促进癌细胞从细胞周期G1进入S期[9]。研究显示,CCAT1的过度表达对结直肠癌、胃癌等多种癌症的发生和发展起促进作用。在非小细胞肺癌细胞系中,CCAT1高表达,在肺癌细胞系中沉默CCAT1的表达,细胞系的增殖和侵袭受到抑制,提示CCAT1在非小细胞肺癌中发挥癌基因的作用,可能是肺癌治疗的潜在靶点[10-11]。

本研究采用实时荧光定量PCR方法检测老年非小细胞肺癌和良性肺病患者两组患者血浆中lncRNA CCAT1的表达水平,发现与良性肺病患者相比,lncRNA CCAT1在非小细胞肺癌患者血浆中表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；进一步分析lncRNA CCAT1的表达及与患者临床特征的关系,发现lncRNA CCAT1表达与患者性别、TNM分期及分化程度无关,差异无统计学意义(P>0.05),与肿瘤体积及淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05)。

综述所述,lncRNA CCAT1在老年非小细胞肺癌患者血浆中高表达,其表达水平与患者临床病理特征关系密切,有可能是评估疾病严重程度潜在的分子标志物。