微纳米共存的磷酸化涂层对钛植入体骨结合的影响

张洁 祝颂松 姜楠

口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院正颌及关节外科，成都610041

钛及钛合金因为其优良的性能和生物相容性而被普遍应用于牙科领域[1]。然而，其表面特性常导致早期骨结合效果较差，并导致植入失败[2]。因此研究人员探索了各种改变钛表面结构/化学的方法，以期改善其早期骨结合效果。目前植入体的表面改性策略主要集中在2个方面：化学改性和微几何结构的改性。其中最为常见的改性方法有：植入体表面涂层、酸蚀或者喷砂粗化处理、阳极氧化或微弧氧化处理以及生物蛋白修饰等。在各种表面改性方法中，磷酸酸蚀因能将对骨再生十分有利的磷元素引入植入体表面受到了学者们的广泛关注。研究[3-4]证实，磷酸酸蚀对加速植入体的骨结合有着十分确切的生物学作用。微几何结构的改性也对植入体的生物活性有着十分重要的影响。从仿生学的角度出发，因为天然骨便是微纳米共存的结构，因此这种结构应该对植入体表面的骨再生更为有利。因此，近年来越来越多的研究[5-6]致力于构建植入体表面的仿生形貌，并且大都取得了令人满意的效果。但遗憾的是，利用磷酸酸蚀的方法在植入体表面构建梯度仿生形貌至今少有文献报道，其相关的生物学作用、生物学机制更是值得探究。

本研究利用特殊压强下碱热磷酸反应法在纯钛植入体表面制备微纳米共存的具备晶体相“磷”的仿生结构，成功地将对成骨有利的磷元素引入植入体表面，提高了植入体的表面能，最为重要的是该表面改性具有微纳米共存的仿生结构，初步探究了该表面改性涂层对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖、黏附以及骨向分化潜能的影响，进而探究其对植入体骨结合的作用。

1 材料和方法

1.1 钛植入体表面处理及分析

1.1.1 表面涂层制备 将一块钛板（纯度99.99%，中国宝鸡钛工业有限公司）加工成直径5 mm、厚1 mm的圆片状（用于细胞实验）和直径1.5 mm、长10 mm的柱状（用于动物实验）。所有钛样品分别使用800、1 200和2 000粒度的SiC砂纸抛光成镜面，随后分别在丙酮、乙醇和蒸馏水中超声荡洗30 min，在真空冷冻干燥机中干燥。

将材料分成2组。第1组材料表面不做任何处理（未处理钛，cp-Ti），直接备用。第2组材料进行仿生磷酸化表面改性处理，利用特殊压强下碱热磷酸反应法在纯钛表面制备出微纳米共存的磷酸化涂层，即钛磷钛（TiP-Ti）。方法为：将样品置于2%HPO4和14%H2O2配制的磷酸水溶液中（共200 mL），然后放入衬有特氟龙膜（teflon）的高压釜，在0.15 MPa、120℃下进行水热反应24 h，获得磷酸化改性形貌。室温下，2组钛片经标准化清洗、钝化，等离子灭菌备用。

1.1.2 钛片的检测 1）表面形貌观察：使用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察所有样品的微观结构。2）表面元素分析：X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析涂层晶相结构。3）涂层厚度及粗糙度：使用原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）观察涂层表面厚度及结构。4）表面能检测：通过静态水接触角实验检测植入材料表面的表面能，使用接触角测角仪（TL101，Biolin Scientific AB）分析涂层表面自由能和湿润性。5）涂层与钛基底的结合强度：通过自动划痕仪检测不同植入材料表面涂层的结合强度。

1.2 体外实验

1.2.1 细胞培养 按照四川大学口腔疾病国家重点实验室动物研究委员会建立的标准进行细胞分离和培养。取1周龄雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨收集BMSCs，将2～4代的细胞用于实验。

1.2.2 细胞形态与黏附 细胞孵育2 h后，PBS洗3次，随后用2.5%戊二醛固定。部分样本用乙醇溶液梯度脱水（20%，40%，60%，80%，90%和100%），喷金，SEM观察细胞早期黏附形态。其余样本的细胞用0.2%Triton X-100透膜15 min后，利用罗丹明-鬼笔环肽标记F-肌动蛋白（F-actin）以显示细胞骨架形态，室温孵育30 min，含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）抗荧光萃灭剂封片。采用SEM和共聚焦扫描电子显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）观察细胞结构和形态。

1.2.3 细胞增殖能力 在24孔培养板中培养灭菌的钛片，培养1、3、5、7、9 d后，使用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）检测细胞活力。

1.2.4 细胞分化 碱性磷酸酶（alkaline phospha‐tase，ALP）活性测定用于检测不同样品上的细胞分化情况。每孔接种5×104个细胞，随后在Ti样品上孵育1、3、7 d。4%多聚甲醛固定，ALP试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）染色并测量其在405 nm处的吸光度值，以确定ALP活性。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应分析（quantita‐tive real-time polymerase chain reaction analysis，qRT-PCR）分别收集与Ti片孵育24、48 h的细胞用于qRT-PCR以评估BMSCs细胞黏附及成骨相关基因表达。检测整合素β1（integrinβ1）、黏着斑蛋白（Vinculin）、Runt相关转录因子-2（Runt-re‐lated transcription factor-2，Runx-2）、Ⅰ型 胶 原（collagen typeⅠ，Col-1）、骨桥蛋白（osteopntin，OPN）和骨钙素（osteocalcin，OCN）相关mRNA的表达。GAPDH作为对照。

1.3 体内实验

1.3.1 植入手术 将12只雌性SD大鼠（3个月大，体重210～230 g）随机分为A、B组。在其双侧胫骨的近干骺端分别植入cp-Ti与TiP-Ti，缝合，术后3 d给予动物肌肉注射抗生素和镇痛药。

1.3.2 micro-CT检测 术后12周，处死A组大鼠（n=6），取双侧股骨、胫骨。将样本置于micro-CT系统检测管内，通过高分辨率μ-CT扫描仪系统（μ-CT 50，Scanco Medical公司，瑞士）进行分析。VOI被定义为植入物周围的骨部分，选取种植体周围250μm范围的环形区域为感兴趣区域。检验参数包括：1）骨体积分数（BV/TV）；2）骨与植入物的接触百分比（骨结合百分比，%OI）；3）骨小梁数量（Tb.N）；4）平均骨小梁间隙（Tb.Sp）。

1.3.3 组织学分析 术后12周，处死B组大鼠（n=6），取双侧股骨、胫骨进行未脱钙处理。使用Lei‐ca DM-RBE显微镜（Leica公司，德国）在生长板下方约1 mm的切片上进行组织学评价。分析内容如下。1）骨面积比：整个组织区域（从植入物表面延伸250μm的环形区域）内成熟骨的百分比。2）骨骼与植入物之间的接触：与植入物界面直接接触的矿化骨骼的线性百分比。

1.3.4 生物力学测试 对μ-CT扫描的样品（n=6）进行生物力学测试，以确定极限剪切强度和最大推出力。使用生物力学测试设备（BSC30，银博科学设备有限公司）以1 mm·min-1的速度检测极限剪切强度（N·mm-2）和最大推出力（N）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0软件对数据进行分析。所有数值以均数±标准差的形式表示，数据分析采用单因素方差分析及Bonferroni检验。

2 结果

2.1 材料表征

2.1.1 表面形貌 SEM（图1）显示：cp-Ti组表面相对光滑，呈浅凹坑状；TiP-Ti组表面呈草样结构，其中短纤维束随机排列形成多孔结构。

图1 2组表面形貌 SEMFig 1 The surface morphology of 2 groups SEM

2.1.2 表面厚度及表面粗糙度 扫描区域为5.0μm×5.0μm时，各组钛片的AFM结果见图2、表1。cp-Ti组钛片表面平坦，光滑；TiP-Ti组钛片表面呈现明显的类山峰状，粗糙度为58.65 nm，在纳米尺寸上规律排列，提示样品表面为纳米级形态。结合图1，TiP-Ti表面呈现为纳米级的3D空间结构与微米级孔隙共存的仿生结构。

表1 2组种植体表面粗糙度指标比较Tab 1 The comparation of surface roughness of 2 groups

2.1.3 表面元素分析 采用XRD对植入材料表面的物相组成进行测量，结果见图3。TiP-Ti组表面探测到典型的Ti特征峰，同时具有新的衍射峰Ti(HPO4)2·0.5 H2O和Ti3O5峰2种物相，证实磷元素成功掺入TiP-Ti表面。

图3 TiP-Ti组XRD分析Fig 3 The results of XRD of TiP-Ti group

2.1.4 表面能检测 静态水接触角实验结果（图4）表明，cp-Ti和TiP-Ti组表面静态水接触角（con‐tact angle，CA）分别为79°±5.3°和7°±2.6°（P＜0.05）。Ti P-Ti表面CA值较低，表明其具有较好的润湿性，这可能有利于蛋白质黏附。

图4 2组CA实验Fig 4 CAexperiment of 2 groups

2.1.5 涂层与钛基底结合强度检测 TiP-Ti组涂层与钛基底结合强度的检测结果见图5。定量分析结果用涂层首次开裂（Lc1）和完全剥脱（Lc2）时的力的值表示，结果显示TiP-Ti组与钛基底结合强度良好，这有利于涂层表面改性在体内发挥生物学作用。

图5 TiP-Ti组划痕实验后材料表面SEM及定量分析Fig 5 SEM and quantitative analysis of the surface of the material after scratch experiment of Ti P-Ti group

2.2 体外实验

2.2.1 细胞黏附能力 孵育2 h后，BMSCs在种植体表面上的黏附结果见图6。cp-Ti组可见少量分散的呈球状细胞，且有丝足结构。TiP-Ti组可见BMSCs分布更广，细胞呈现椭圆形，细胞伸展较好，并伴有更清晰的细胞骨架（图6A），且有明显连接的伪足结构。黏附相关mRNA表达结果（图6B）显示，在TiP-Ti组材料表面，细胞黏附相关的蛋白表达量相对较多。这表明，BMSCs在TiPTi表面具有更好的黏附。

图6 2组材料表面BMSCs的黏附情况Fig 6 Adhesion of BMSCs on the surface of 2 groups

2.2.2 细胞增殖 MTT结果（图7）表明，与cp-Ti组相比，TiP-Ti组细胞活力增加（除第1天外，P＜0.05）。这表明，BMSCs在TiP-Ti表面具有更好的增殖能力。

图7 2组MTT结果Fig 7 MTT assay of 2 groups

2.2.3 细胞分化 ALP活性测定结果（图8）显示，TiP-Ti组细胞ALP活性高于cp-Ti组（P＜0.05）。qRT-PCR检测（图9）显示，TiP-Ti组Runx-2、Col-1、OPN、OCN mRNA表达水平均高于cp-Ti组（P＜0.05）。这表明，BMSCs在TiP-Ti表面表现出更好的成骨向分化。

图8 2组ALP检测结果Fig 8 The ALP results of 2 groups

图9 2组BMSCs成骨向分化相关基因的相对表达情况Fig 9 mRNA expression levels of Col-1,Runx-2,OPN,and OCN,detected by qRT-PCR of 2 groups

2.3 体内实验

术后12周，大鼠创面均已实现愈合，Ti植入物均在骨内保持良好位置。

2.3.1 Micro-CT及组织学分析 Micro-CT检测结果（图10）表明，与cp-Ti组相比，TiP-Ti组BV/TV、%OI、Tb.N增加（P＜0.05），Tb.sp降低（P＜0.05）。形态计量学（图11）表明，TiP-Ti组骨面积比、骨骼与植入物之间的接触均高于cp-Ti组，表现出骨愈合效果。这表明，TiP-Ti诱导了与宿主组织的更牢固的界面结合。

图10 2组micro-CT检测结果Fig 10 The results of micro-CT of 2 groups

图11 2组组织学分析Fig 11 Histological analysis of 2 groups

2.3.2 生物力学检测 生物力学测试结果（表2）表明，TiP-Ti组种植体显示出更强的机械稳定性（P＜0.05）。TiP-Ti组剪切强度超过20 N·mm-2，是cp-Ti的2倍多；最大推出力为182.7 N，是cp-Ti的5倍多。

表2 2组生物力学测试结果比较Tab 2 Comparison of biomechanical test results of 2 groups

3 讨论

3.1 微纳米共存的仿生结构形成机制及特征

本研究利用特殊压强下碱热磷酸反应法（0.15 MPa，120℃）成功地在纯钛植入体表面制备了微纳米共存的具备晶体相“磷”的表面仿生结构（TiP-Ti）。有部分学者探究了种植体表面3D结构改性的方法，试图改善种植体骨结合能力。Sul[7]通过电化学微弧氧化，成功地将P阴离子掺入到了TiO2涂层（孔径1.3～1.5μm）中，并且报道了该结构具有更强的骨结合效果，但是未提到体外细胞实验的细节。Park等[8-9]采用碱热反应处理钛氧化物表面，获得了具有微米级的粗糙形貌，该形貌具有较强的MC3T4-E1细胞附着力、活力和成骨细胞基因表达。本实验经0.15 MPa、120℃特殊温度压强下处理获得了具有晶体相“磷”的微/纳米级共存的仿生混合涂层。XRD结果显示，TiP-Ti表面化学元素主要以Ti(HPO4)2·0.5H2O/Ti3O5晶体相存在。制备该涂层过程中，采用了较低浓度的H3PO4及较高浓度的H2O2，因此溶解的Ti4+与更丰富的H2O2反应形成稳定的Ti2O3，与TiO2进一步反应形成Ti3O5[10]，Ti3O5与磷酸根或磷酸氢根离子之间的进一步相互作用形成Ti(HPO4)2·0.5H2O/Ti3O5化合物[11]。这也意味着掺入的P元素呈现高度结晶态。

SEM观察表明，TiP-Ti涂层表面形态呈规律排列的微米结构，其中短纤维束随机排列形成多孔结构。AFM观察到的规律排列纳米级结构，可以证实该涂层为纳米级的3D空间结构与微米级孔隙共存的仿生结构。生物材料的表面润湿性在蛋白质吸附中起着重要作用，进而对细胞的黏附和增殖产生显著影响[12]。通过静态水接触角实验来检测植入材料表面的表面能，结果表明，TiP-Ti表面CA值较低，表明其具有较好的润湿性，这可能有利于蛋白的黏附。表面划痕实验结果显示，涂层首次开裂和完全剥脱时的力分别为18.5 N和25.8 N，这与文献[13]报道的涂层改性的表面结合强度结果相符，证实本研究涂层改性与钛基底结合强度较好，这也为该植入体表面改性技术将来的应用打下了基础。

3.2 微纳米共存的仿生结构对BMSCs生物学行为的影响

本研究结果表明，TiP-Ti表面BMSCs的黏附、增殖与分化高于cp-Ti。在TiP-Ti表面的细胞表现出更明显连接的伪足，这与其较高的F-actin表达一致。F-actin免疫荧光显示，黏附在TiP-Ti上的细胞具有更强的荧光强度，显示出更清晰的细胞骨架结构（图6A）。细胞黏附情况与润湿性检测结果一致（图4），即TiP-Ti＞cp-Ti，证明了材料表面形态和润湿性会直接影响到细胞黏附情况[14-16]。另外，qRT-PCR检测黏附相关的mRNA结果证实，TiP-Ti表面的细胞整合素β1和Vinculin表达较强。

细胞在钛片表面培养1、3、5、7、9 d，TiPTi组细胞的增殖率明显高于cp-Ti组（P＜0.05），这与细胞在TiP-Ti表面具有良好的黏附形态一致。

间充质干细胞沿成骨细胞谱系的分化是植入物骨结合的关键[17]，且该过程受植入物材料表征的影响[9]。磷改性的Ti植入体可以促进BMSCs的分化[9,18]。研究[19-20]显示，与无定形状态的磷酸盐相比，结晶态磷酸盐更有利于BMSCs的分化和骨沉积。然而到目前为止，尚未有研究比较过BM‐SCs在由Ti、Ti氧化物和Ti磷酸盐组成的材料表面上的分化情况。由于植入物表面黏附的细胞通过激活的相关局部信号从而调控植入体周围的破骨细胞的活动和骨沉积，因此植入体的表面形貌对BMSCs的成骨向分化也有一定影响[21]。ALP活性测定结果显示，TiP-Ti组ALP活性显著高于cp-Ti组（P＜0.05）。mRNA表达水平结果显示，与cp-Ti组相比，TiP-Ti组中Col-1和Runx-2的表达水平显著上调，证实TiP-Ti对成骨早期阶段有较强的促进作用，这与早期的ALP分析、CLSM观察结果相符。另一方面，OPN和OCN的mRNA表达水平也显示，TiP-Ti组表现出较好的促进细胞成骨向分化能力。

3.3 微纳米共存的仿生结构对骨结合的影响

体外和体内研究均显示，TiP-Ti在细胞增殖、黏附、分化以及促进植入物骨结合方面具有较佳的性能。这可能是由植入物表面化学作用（掺有结晶TiP的Ti氧化物）、微/纳米级共存的仿生表面形态以及表面良好亲水性的综合作用所致。另外，在松质骨中存在微米级的孔隙不仅提供了血液循环和营养供给的途径，且与新生骨之间形成机械锁嵌结构，有助于增强生物力学稳定性[22]。多孔排列结构可以在一定程度上促进细胞黏附[23]。研究还证实，微米/纳米级共存结构可以迅速激活局部免疫反应，刺激细胞跨膜蛋白的黏附和细胞的早期黏附[8,24]，并促进羟磷灰石的沉积和成骨细胞的增殖[25]。

综上，本研究在Ti植入物表面制备了具有晶体相“磷”的微/纳米级共存的仿生混合涂层，以增强其骨结合性能。此外，具有微/纳米级共存的TiP-Ti在体外和体内均表现出优良的促成骨性能。结果表明，本研究中生产的杂化涂层的表面化学组成及表面形貌均对细胞生物学行为具有明显的影响，继而影响植入物的骨结合及生物力学稳定性，是一种具有应用前景的植入体表面改性。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。