APOE基因多态性与慢性疾病对老年抑郁症患者的影响

王 欣 李月娥 木坦力甫江·买买提

抑郁症是指各种原因引起的以显著而持久的心境低落和认知功能障碍为主要临床特征的一种心境及情感障碍性疾病，具有高患病率、复发率、自杀率及致残性等特点，严重威胁患者身体健康，给家庭和社会造成了沉重心理和经济负担，是目前重要的社会公共卫生问题之一[1，2]。有数据统计，近年来抑郁症患病率显著上升，以老年患者上升居多[3]。研究发现，基因遗传在抑郁症发生发展过程中占有重要地位，全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)发现载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)、多巴胺D4受体(Dopamine Receptor D4,DRD4)、G蛋白β3亚单位(G-protein β3Submit,GNB3)和亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate Reductase,MTHFR)等候选基因与抑郁症显著相关[4]。有研究表明，慢性疾病和候选基因在老年抑郁症发生发展过程中占有重要地位，但目前关于两者对老年抑郁症的影响尚不十分清晰[5,6]。前期发现老年抑郁症患者APOE基因异常，故本研究选取180例老年抑郁症患者和180名健康体检老年人作为研究对象，探讨APOE基因多态性与慢性疾病及二者交互作用对老年抑郁症患者的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年1月～2019年6月于乌鲁木齐市第四人民医院确诊的180例老年抑郁症患者为研究组，纳入标准：(1)符合美国精神障碍诊断与统计手册第5版(DSM-5)[7]中抑郁症的诊断；(2)汉族，年龄≥60岁；(3)经汉密尔顿抑郁量表24项(Hamilton Depression Scale,HAMD-24)评分>20分；(4)首次诊断。排除标准：(1)2周内接受过抗抑郁治疗者；(2)存在脑器质性精神障碍及其他精神疾病者；(3)有遗传性精神病史者；(4)近半年接受过输血治疗者；(5)临床资料不完整者。同期选取180名行健康体检的健康汉族老年人作为对照组(排除HAMD-24评分≥8分者、有家族遗传性精神病史者及两系三代中有异族通婚史者)。研究组男80例，女100例；平均年龄(67.15±5.38)岁；婚姻状况：未婚18例，已婚112例，离异/其他50例；宗教信仰：有28例，无152例。对照组男82例，女98例；平均年龄(68.08±5.61)岁；婚姻状况：未婚15例，已婚122例，离异/其他43例；宗教信仰：有35例，无145例。两组在性别、年龄、婚姻状况和宗教信仰等一般资料上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均签署知情同意书并通过相关伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 慢性疾病调查 通过询问既往病史和目前临床症状确认所有研究对象慢性疾病患病情况，主要涉及的慢性疾病包括：心血管疾病(冠心病和高血压)、脑血管疾病(短暂性脑缺血发作和脑卒中)、呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病)、消化系统疾病(胃肠道溃疡和慢性胃炎)、风湿内分泌疾病(类风湿性关节炎和糖尿病)、骨关节病、听力障碍、青光眼和白内障等。

1.2.2 血液APOE基因多态性检测

1.2.2.1 血液收集 入组当天抽取5 ml外周静脉血于含乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid,EDTA)抗凝管中，充分混匀后储存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.2.2.2 基因组DNA提取 采用NA2010 GenElute Blood Genomic DNA Kit(美国Sigma公司)提取血液DNA，具体步骤如下：(1)取100 μl血液置于1.5 ml微型试管；(2)将40 μl磁珠和750 μl溶解吸附液加入微型试管中，充分混合10 min；(3)将其置于磁性台架30 s，并去除上清液；(4)将900 μl清洗液加入微型试管中，充分混合5 s，并将其置于磁性台架30 s，去除上清液(重复2次)；(5)将900 μl 70%乙醇加入微型试管中，充分混合5 s，并将其置于磁性台架30 s，去除上清液(重复2次)；(6)将100 μl灭菌水加入微型试管中，充分混合使基因组DNA溶出。

1.2.2.3 DNA浓度测定 取4 μl基因组DNA，稀释25倍，后用紫外分光光度计检测DNA浓度、质量和OD260/280，后将其存于-20 ℃冰箱。

1.2.2.4 APOE基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)进行检测，具体步骤如下：(1)APOE基因引物设计，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，上下游引物分别为5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’和5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3’；(2)PCR扩增，扩增体系(10 μl)：1 μl 10×Buffer、0.2 μl上游/下游引物、0.3 μl dNTPs、1 μl DNA模板、6.68 μl ddH2O和0.52 μl MgCl2，扩增程序：95 ℃ 15 min、94 ℃ 40 s-63 ℃ 1 min-72 ℃ 1.5 min(15个循环)、94 ℃ 40 s-56 ℃ 40 s-72 ℃ 1.5 min(25个循环)、72 ℃ 8 min；(3)PCR产物酶切：反应体系10 μl PCR产物、10 μl酶混合液(虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I)和10 μl ddH2O，反应条件37 ℃水浴中消化过夜；(4)基因型确定：取5 μl PCR酶切产物加入到12%聚丙烯酰胺凝胶电泳中确定其基因型。APOE基因在rs429358与rs7412有3种等位基因：ε2、ε3、ε4，6种基因型：纯合子(ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4)和杂合子(ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4)，其中等位基因频率=[(2×纯合子+杂合子)/(2×受检总例数)]×100%。

2 结果

2.1 APOE基因Hardy-Weinburg遗传平衡吻合度检验 经拟合优度χ2检验，研究组、对照组和总体研究样本APOE基因型分布频率比较，差异无统计学意义(χ2=4.23，P=0.078)，符合Hardy-Weinburg遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.2 两组APOE基因型和等位基因频率比较 两组APOE基因型和等位基因频率比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组APOE基因型和等位基因频率比较[n(%)]

2.3 两组慢性疾病患病情况比较 研究组慢性疾病患病率高于对照组(P<0.05)。研究组慢性疾病涉及个数和系统为2个以上的比例均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组慢性疾病患病情况比较[n(%)]

2.4 APOE基因和慢性疾病对老年抑郁症影响的多因素分析 将是否患有老年抑郁症作为因变量，将混杂因素(性别、婚姻状况和宗教信仰)、APOE基因型、等位基因和慢性疾病等作为自变量纳入Logistic回归模型，结果显示：APOE ε4ε4基因型、ε4等位基因、患者患2个以上慢性疾病或涉及2个以上系统是影响老年抑郁症的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 APOE基因和慢性疾病对老年抑郁症影响的多因素分析

2.5 APOE基因和慢性疾病交互作用对老年抑郁症的影响分析 调整性别、婚姻状况和宗教信仰后，APOE ε4ε4基因型与慢性疾病患病2个以上个数对老年抑郁症存在交互作用[ORint(95%CI)=1.252(1.016～1.379),P=0.023]，APOE ε4ε4基因型与慢性疾病患病2个以上系统对老年抑郁症存在交互作用[ORint(95%CI)=1.307(1.108～1.495),P=0.016]；APOE ε4等位基因与慢性疾病患病2个以上个数对老年抑郁症存在交互作用[ORint(95%CI)=1.342(1.192～1.559),P=0.019]，APOE ε4等位基因与慢性疾病患病2个以上系统对老年抑郁症存在交互作用[ORint(95%CI)=1.294(1.067～1.417),P=0.013]。见表4。

表4 APOE基因和慢性疾病交互作用对老年抑郁症的影响分析

3 讨论

抑郁症是老年期最常见的精神性疾病之一，严重影响患者生活质量，不利于社会进步[8]。APOE主要存在于多种脂蛋白颗粒中，在对极低密度脂蛋白进行研究中被首次发现，与脂质代谢相关；后期研究发现其还参与神经细胞的生长和修复，与基因多态性相关[9，10]。研究发现，人APOE编码基因主要位于19q13.2，包含4个外显子和3个内含子，有ε2、ε3、ε4 3个等位基因，共同构成6种基因型：纯合子(ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4)和杂合子(ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4)，但在不同人种和区域中可存在差异[11]。本研究APOE基因型和等位基因种类与上述结论一致，后经拟合优度χ2检验分析得知研究组、对照组和总体研究样本APOE基因型分布频率比较差异无统计学意义，符合Hardy-Weinburg遗传平衡定律，具有群体代表性，说明本研究结论可信。

Ramachandran G等[12]学者在研究抑郁症时发现，APOE ε3ε4基因型与抑郁症相关，首次提出APOE基因多态性与抑郁症的关系。后续越来越多的学者展开了对APOE基因多态性与抑郁症关系的研究，发现抑郁症患者和健康对照人群APOE基因型和等位基因分布频率比较差异无统计学意义[13，14]。但在本研究中，老年抑郁症患者和对照组血液APOE基因型和等位基因分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与研究对象选取有关；此外，本研究还发现老年抑郁症患者中APOE ε4ε4和ε3ε4基因型、APOE ε4等位基因占比远高于对照组，说明ε4可能与老年抑郁症相关，这与袁勇贵等[15]部分研究结果基本一致。

众所周知，抑郁症是一种复杂疾病，是基因与环境共同作用的结果[16]。研究发现，在老年抑郁症这个特殊群体中，慢性疾病在抑郁症发生发展过程中的作用不可忽视，但对其具体影响程度研究较少[17]。综合以上观点提示，基因和慢性疾病对老年抑郁症影响较大，但具体影响方式尚不清楚。为此，本研究纳入Logistic回归模型进行分析发现，在校正性别、婚姻状况和宗教信仰等混杂因素后APOE ε4ε4基因型、ε4等位基因以及2个以上慢性疾病个数和系统仍是影响老年抑郁症的独立危险因素(P<0.05)，与陈浙丽等[18]学者部分观点一致，提示临床工作者应重视携带APOE ε4等位基因，且慢性疾病个数和涉及系统在2个以上的老年患者，必要时可通过基因治疗进行靶向干预，最大可能减少老年抑郁症发生。此外，本研究还通过Logistic回归模型进行了交互分析发现APOE基因或慢性疾病单项作用对老年抑郁症影响不大，但两者正交互，互相正向影响最终导致抑郁症发生。

综上认为，APOE基因多态性和慢性疾病与老年抑郁症相关，两者交互共同导致其发生，为老年抑郁症诊疗提供了新的方向。但本研究仍存在以下局限性：(1)样本量较少；(2)本研究仅将性别、婚姻状况和宗教信仰等部分混杂因素纳入Logistic回归分析模型，但是还可能受到其他因素干扰；因此后续可扩大样本量及控制其他干扰因素以进一步证实本研究结论。