结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1 水平变化及临床意义

高杨，康荣基，曹宇

辽阳市中心医院普外科，辽宁辽阳 111000

结肠癌是高发病率和高病死率的消化道恶性肿瘤，随着生活方式和饮食习惯的改变以及肿瘤诊断技术的提高，我国结肠癌发病率呈上升趋势［1］。多数患者早期无典型症状，确诊时大都处于中晚期，术后易复发转移，预后差。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200 nt，自主转录的非编码RNA，在表观遗传、调控转录及转录后基因表达中有重要作用，异常表达可能对细胞增殖、肿瘤进展或转移产生影响［2-3］。锌指蛋白反义链1（ZFAS1）是一种与肿瘤相关的lncRNA，在不同恶性肿瘤中发挥不同作用机制，在乳腺癌中表达下调，低表达可促使乳腺癌细胞增殖［4］，但在食管鳞状细胞癌中表达上调，过表达可促进癌细胞增殖、迁移和侵袭［5］。lncRNA ZFAS1 在结肠癌中的报道较少，因此本研究观察了结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1 水平变化，初步探讨其临床意义，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年2月—2017年7月我院收治的102例结肠癌患者（结肠癌组）。其中男63例，女39例；年龄45～79（62. 41 ± 6. 21）岁（<60 岁44例、≥60岁58例）；病理类型：腺癌72例，腺鳞癌21例，其他9例；肿瘤直径：>5 cm 59例，≤5 cm 43例；分化程度：低分化47例，中分化37例，高分化18例；T分期：T1～T2期41例，T3～T4期61例；N 分期：N0期79例，N1～N2期23例。纳入标准：①入院后均行以手术为主的综合治疗，术后组织病理学证实为结肠癌；②采集血标本前未进行手术、放化疗以及中医药等抗肿瘤治疗；③病理资料完整，同意并配合随访。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②发生远处转移丧失手术治疗时机，未获得大体病理组织标本，病理资料缺失；③合并心血管疾病。另选择同期于我院门诊体检的54例健康志愿者为对照组，均经系统检查（肿瘤标志物、影像学检查等）排除恶性肿瘤。其中男37例、女17例，年龄60～80（67. 25 ± 6. 25）岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义。本研究已经获得我院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 血清lncRNA ZFAS1 检测 结肠癌组入院后第2天（手术前）清晨（对照组体检当日）采集外周静脉血3 mL 注入干燥试管，待血液凝固后取上清液，离心（3 000 r/min，离心半径10 cm，离心时间5 min）后取血清上机检测，当日未检测样本-20 ℃保存，48 h内检测完毕。采用实时荧光定量PCR技术检测血清lncRNA ZFAS1。 取血清样本100 μL，加入TRIzol RNA提取试剂（美国Thermo Fisher公司）参照说明书分步提取组织RNA。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，选取OD260/OD280为1. 9～2. 1的RNA，M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）将RNA 逆转录为cDNA。取2 μL cDNA样品加入实时荧光定量PCR体系，引物合成及序列测定由上海基康公司完成。lncRNA ZFAS1 上游引物序列：5'⁃ACGTGCAGACATCTACAACCT⁃3'，下游引物序列：5'⁃TACTTCCAACACCCGCAT⁃3'；βactin 上游引物序列：5'⁃TGCGTGACATTAAGGAGAA⁃3'，下游引物序列：5'⁃AAGGAAGGCTGGAAGAGT⁃3'。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s 共40个循环。反应体系：SYBR®Premix Ex Taq ™Ⅱ（2×）12. 5 μL，dNTP 1. 6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，加反应缓冲液至25 μL。75 ℃读取荧光，构建熔解曲线。以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA ZFAS1 相对表达量，共做3次平行试验，取平均值。

1.3 随访 采用门诊复查或电话随访形式进行随访3年，统计随访期间无进展生存（PFS）和总生存（OS）情况。PFS定义为自病理确诊日期至肿瘤复发转移、任何原因引起的死亡或随访结束时间，OS 定义为自病理确诊日期到因任何原因引起的死亡或随访结束时间。

1.4 统计学方法 采用SPSS25. 0 统计软件。采用Kolmogorov-Smirnov 法对计量资料进行拟合优度检验，符合正态分布以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（两两比较采用LSD-t检验），两组比较采用独立样本t检验；Kaplan-Meier 法绘制血清不同lncRNA ZFAS1 水平结肠癌患者生存曲线，Log-Rank 检验生存率的差异；Cox 比例风险模型分析影响结肠癌患者预后的危险因素。P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清lncRNA ZFAS1 水平比较 结肠癌组、对照组血清lncRNA ZFAS1 水平分别为3. 41 ±0. 81、1. 05 ± 0. 27，结肠癌组高于对照组（t=20. 780，P<0. 01）。

2.2 不同临床病理特征结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1水平比较 见表1。

表1 不同临床病理特征结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1水平比较（± s）

表1 不同临床病理特征结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1水平比较（± s）

注：与低分化比较，aP<0. 05；与中分化比较，bP<0. 05。

临床病理特征年龄<60岁≥60岁性别男 女肿瘤直径>5 cm≤5 cm病理类型腺癌腺鳞癌其他分化程度低分化中分化高分化T分期T1～T2期T3～T4期N分期N0期N1～N2期n 44 58 63 39 59 43 72 21 9 47 37 18 41 61 79 23 lncRNA ZFAS1 3. 38 ± 0. 80 3. 43 ± 0. 79 3. 45 ± 0. 75 3. 35 ± 0. 81 3. 37 ± 0. 80 3. 47 ± 0. 72 3. 44 ± 0. 73 3. 38 ± 0. 68 3. 24 ± 0. 79 3. 78 ± 0. 15 3. 21 ± 0. 21a 2. 86 ± 0. 20ab 2. 67 ± 0. 05 3. 91 ± 0. 30 3. 25 ± 0. 31 3. 97 ± 0. 22 F/t 0. 315 0. 635 0. 650 0. 327 184. 249 26. 182 10. 386 P 0. 754 0. 527 0. 517 0. 722<0. 001<0. 001<0. 001

2.3 不同lncRNA ZFAS1 水平结肠癌患者生存比较 随访期间死亡33例，复发15例，远处转移10例，绘制Kaplan-Meier 生存曲线分析发现，lncRNA ZFAS1 高水平者（lncRNA ZFAS1≥3. 41，53例）3年PFS 率为32. 08%（17/53），3年OS 率为56. 60%（30/53），低于lncRNA ZFAS1 低水平者（lncRNA ZFAS1<3. 41，49例）的55. 10%（27/49）、79. 59%（39/49）（Log-Rankχ2=5. 489、6. 043，P=0. 019、0. 014）。

2.4 结肠癌患者生存的影响因素分析结果 以结肠癌患者生存情况为因变量（存活=0，死亡=1），纳入年龄（赋值：<60 岁=0，≥60 岁=1）、性别（赋值：男=0，女=1）、肿瘤直径（赋值：≤5 cm=0，>5 cm=1）、病理类型（赋值：腺癌=1、腺鳞癌及其他=0）、分化程度（赋值：高分化=0，低中分化=1）、T分期（赋值：T1～T2期=0，T3～T4期=1）、N 分期（赋值：N0=0，N1～N2=1）、lncRNA ZFAS1（赋值：低水平lncRNA ZFAS1=0，高水平lncRNA ZFAS1=1）为自变量。单因素Cox 比例风险回归分析（Enter 法筛选变量）结果显示分化程度、T 分期、N 分期、lncRNA ZFAS1 水平与结肠癌患者预后有关（P均<0. 01），见表2。将单因素分析中有统计学差异项目纳入多因素Cox 比例风险回归模型（Enter 法筛选变量），结果显示N1～N2期、高水平lncRNA ZFAS1 是结肠癌患者不良预后的危险因素（P均<0. 01），见表3。

表2 影响结肠癌患者预后的单因素Cox比例风险回归分析结果

表3 影响结肠癌患者预后的多因素Cox比例风险回归分析结果

3 讨论

结肠癌是一种异质性肿瘤，具有高度侵袭性和转移性，是癌症相关死亡的主要原因，大约50% 中晚期结肠癌患者可发生远处转移，预后较差［6］。手术、放化疗是治疗结直肠癌的主要手段，近年来虽然诊断和治疗技术取得了很大进步，但是结肠癌患者远期生存率仍然较低。探讨与结肠癌相关的分子生物学标志物对临床诊断、指导治疗、预后评估均有重要意义。

lncRNA是具有高组织特异性的RNA，人类和哺乳动物多数基因组产物以lncRNA 形式存在。既往研究认为lncRNA无蛋白质编码功能，缺乏或无开放阅读编码框生物学功能，现在越来越多研究发现lncRNA 具有染色质和基因组结构重塑、组蛋白修饰、细胞周期调控、基因组印迹、转录后调节基因表达等多种生物学功能［7］。lncRNA 作为增强剂、支架或诱饵通过与其他RNA 或蛋白质相互作用，影响细胞信号级联，调节绝大多数生理病理过程，lncRNA表达异常影响蛋白或核酸功能以及稳定性，参与多种疾病包括恶性肿瘤的发生和发展，在肿瘤增殖、存活、迁移、耐药、基因组稳定性等方面发挥重要作用［8］。现有研究发现，多种lncRNA 调控失调通过信号途径参与了结肠癌的发病进展［9-10］。ZFAS1 是一种新发现的lncRNA，定位于人类染色体20q13，广泛表达于脑、肾、胰腺、心脏等组织的细胞核和细胞质中，具有翻译、mRNA 剪接和修复、细胞间黏附作用，参与细胞增殖凋亡，上皮—间质转化和细胞迁移过程，与多种恶性肿瘤发病有关［11］。lncRNA ZFAS1在正常乳腺组织中高表达，在乳腺癌组织中表达下调，ZFAS1过表达通过抑制上皮—间质转化抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭［12］，提示ZFAS1 可能是乳腺癌的肿瘤抑制因子。lncRNA ZFAS1 在头颈部鳞状细胞癌表达上调，可抑制miR-150-5p 表达，促使上皮—间质转化和癌细胞转移［13］。在胃癌中，ZFAS1 通过影响Wnt/β-链蛋白信号传导和表观遗传抑制Wnt 信号传导途径2（NKD2）的Kruppel 样因子2（KLF2）和NKD抑制剂促使癌症进展［14］。

本研究发现，结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1水平增高，与结肠癌分化程度、T分期、N分期有关，说明lncRNA ZFAS1在结肠癌中发挥癌基因作用［15］。本研究通过随访和预后分析发现，高水平lncRNA ZFAS1与结肠癌患者低PFS 率和低OS率有关，是结肠癌患者预后不良的危险因素，说明lncRNA ZFAS1可以作为结肠癌预后判断的指标。分析lncRNA ZFAS1 参与结肠癌病情进展的机制如下：①肿瘤生长和增殖过程中需要新生血管的形成，lncRNA ZFAS1 可与miR-150-5p竞争性结合上调血管内皮生长因子A（VEGFA）表达［16］，促进新生血管形成和结直肠癌进展。②lncRNA ZFAS1通过靶向miR-590-3p调控细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1），抑制癌细胞凋亡，促使癌细胞增殖［17］。③lncRNA ZFASI是C/D盒SNOR⁃NAs的宿主和载体，SNORDs通过引导核糖体RNA位点特异性的甲基化参与恶性肿瘤发生和进展，ln⁃cRNA ZFAS1 通过识别SNORDs NOP58 蛋白，加速SNORD12C/78 合成，促使核糖体RNA 的2'-O-甲基化，促使 结肠癌癌细 胞增殖迁 移［18］。 ④lncRNA ZFAS1 还可通过携带特定基序（AAGA 或CAGA）直接募集DDX21蛋白，调控其下游基因POLR1B表达，促使癌细胞增殖、侵袭、迁移［19］。

综上可见，结肠癌患者血清lncRNA ZFAS1 水平升高，lncRNA ZFAS1 水平与结肠癌分化程度、T分期和N分期有关，高水平lncRNA ZFAS1是结肠癌预后不良的危险因素。lncRNA ZFAS1 有望作为结肠癌预后预测的潜在标志物。