柴胡加龙骨牡蛎汤调控NF-κB信号通路对癫痫大鼠神经炎症及海马神经元损伤的影响

王 倩，曾 培，袁莉莉，张永玲，白永利，范文涛

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003)

癫痫(Epilepsy,EP)是大脑神经元超同步化反复异常放电所引起的以暂时性意识丧失、口吐白沫、四肢肌肉强直抽搐为主要临床表现的一种中枢神经系统功能障碍性疾病。中国范围内现有癫痫患者大约九百多万人，全球平均每天新发癫痫病例大约6000例左右，且80%左右的癫痫患者生活在发展中和经济偏于落后的国家和地区，由于受到经济和医疗条件的限制很多癫痫患者并未得到全面的治疗[1]。

前期研究发现，癫痫的发病可能是NF-κB信号通路、炎症因子共同作用的结果[2]。本文研究柴胡加龙骨牡蛎汤对NF-κB信号通路的影响，为明确柴胡加龙骨牡蛎汤治疗癫痫的作用机制提供分子生物学支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物 西安交通大学实验动物中心购买SPF级健康SD雄性大鼠60只，鼠的年龄25～26周，体重为180～220 g左右，动物许可证号:SCXK(陕)2017-003。购买后的大鼠需要适应性饲养1周，自由饮水与进食，室温(21±2)℃，湿度40%～50%，1周后进行相关动物实验。

1.2 实验药品、试剂 硫酸阿托品注射液、丙戊酸钠片、毛果芸香碱、氯化锂、IL-6/TNF-α ELISA试剂盒、HE染色试剂盒、β-actin、NF-κBp65兔多克隆抗体、BCA蛋白测定试剂盒。

1.3 动物分组与造模

1.3.1 分组：采用随机数字表法选取SPF级SD成年大鼠60只，然后随机将大鼠分成六组，分别设为空白组、模型组、丙戊酸钠组和柴胡加龙骨牡蛎汤高、中、低剂量组，每组大鼠有10只，且均为雄性SD大鼠。

1.3.2 颞叶癫痫大鼠造模：将氯化锂注射液调配成127 mg/kg，每只大鼠进行称重记录，然后行腹腔注射，记录时间，注射完氯化锂后间隔18～24 h，再给予1 mg/kg阿托品腹腔注射，以抑制匹罗卡品注射后大鼠出现的外周胆碱能反应。30 min后开始按32 mg/kg的比例给予匹罗卡品腹腔注射，注射完药物后，将大鼠放入笼中，密切观察每只大鼠的反应。大约5 min左右大鼠陆续出现嘴角流涎、吐白沫、鼓腮、不断挠胡须、眼球充血流血泪等症状，部分大鼠开始出现面部频繁抽动，四肢强直颤栗抖动，甚则双上肢出现直立、头后仰、旋转、摔倒等，如Racine发作等级标准表中的发作症状(0级：没有癫痫发作的任何症状；Ⅰ级：胡须抖动，鼓腮，面部时有抽搐；Ⅱ级：全身阵挛性抽动，口角流涎，节律性点头，背部毛湿润；Ⅲ级：同Ⅱ级，出现上肢站立性抖动；Ⅳ级：全身阵挛性抽搐，后肢直立；Ⅴ级：反复跌倒，全身肌肉强直，抽搐频繁)。大鼠癫痫发作等级达到Ⅳ级及以上，且发作时间持续30 min以上者则为癫痫模型成功，没有达到以上发作级别和发作时间的，则表明造模没有成功，需按10 mg/kg匹罗卡品量每间隔30 min追加1次，连续追加3次仍未达到以上发作级别和时间要求者，则为造模失败，予以剔除。造模过程中有3只发作级别没有达到Ⅳ级或Ⅳ级以上，予以剔除，造模过程中因癫痫大发作死亡5只，模型成功大鼠给予30 mg/kg水合氯醛以缓解癫痫大发作的痉挛状态，在注射水合氯醛过程中有2只大鼠死亡，可能与水合氯醛注射过量有关。造模成功后比较虚弱的大鼠，每只给予3 ml葡萄糖氯化钠注射液进行营养支持治疗，每天分早晚2次，连续给予3 d。每组大鼠给予常规饲料喂养，正常饮水。

1.4 药物及给药方法

1.4.1 柴胡加龙骨牡蛎汤：柴胡12 g，龙骨、生姜、党参、桂枝、茯苓、牡蛎各4.5 g，半夏10 g，黄芩3 g，大黄6 g，大枣6枚(原方中有铅丹，但因铅丹有毒，所以方中未加铅丹)。煎药方法：将龙骨、牡蛎放入先煎30 min，然后再加入剩余药物，武火煮沸，文火再煎25 min，共煎2次，将两次所煎药物混合在一起，待药物冷却以后放入4 ℃冰箱备用。每次灌胃前将药物倒出一定的量，放入温水中加热。

1.4.2 给药方法与剂量：空白组与模型组每天给予相同剂量的0.9%氯化钠灌胃治疗，0.9%氯化钠剂量为10 ml/kg，1次/d。丙戊酸钠组：每天给丙戊酸钠组1.6 mg/kg体重，溶于2.5 ml0.9%氯化钠灌胃，1次/d。柴胡加龙骨牡蛎汤组：每天给予按生药18、9、4.5 g/kg体重溶于2.5 ml0.9%氯化钠灌胃，1次/d，分为柴胡加龙骨牡蛎汤高、中、低剂量组。灌胃疗程为4周，模型复制成功后，从造模成功后第2天开始进行中药灌胃干预疗法，连续灌胃4周。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 大鼠行为学:造模成功后和治疗期间观察各组大鼠癫痫发作的频率、次数和每次发作的持续时间，进食情况同时测量大鼠体重的变化。

1.5.2 海马组织HE染色:将海马组织浸泡在4%的多聚甲醛中24 h后，取出用清水水洗，依次放入梯度酒精和二甲苯中脱水过夜15 h、脱水后取出用石蜡进行包埋，将包埋后的组织取出，用切片机切成厚约3 μm的薄片，放入恒温池中，再用载玻片进行捞片，烘烤1 h左右。按照HE染色步骤进行。

1.5.3 TNF-α、IL-6 按照ELISA及Western blot实验步骤进行。

2 结 果

2.1 大鼠一般行为学变化 空白组大鼠每日正常进食饮水，较活跃，呈聚集式围拢在一块，毛色光亮，大便致密呈颗粒状；造模组大鼠1周内，每日癫痫发作较频繁，发作时上肢直立、口吐涎沫、全身肌肉痉挛抽搐甚则向后颠倒，眼球怒睁，易激惹状，毛发竖立呈“湿狗状”、大鼠之间容易发生撕咬现象，发作结束后精神萎靡，进食饮水也较空白组大鼠减少，大便稀溏，体重明显减轻；治疗组经每日柴胡加龙骨牡蛎汤和丙戊酸钠灌胃治疗2周后，每日癫痫发作的级别、时间、程度、进食饮水情况、体重等都有所改变；其中高剂量组癫痫发作次数减少较明显，每日发作的级别和程度都有所减少，进食饮水明显增加，体重逐渐增加；丙戊酸钠组和中剂量组大鼠每日癫痫发作次数、发作级别和发作时间也较灌胃前相比有所减少，进食饮水有所增多，体重有所增加；小剂量组大鼠每日癫痫发作次数和级别与灌胃治疗前相比有所减少，进食增多，体重也有所增加。

2.2 各组大鼠体重变化 在造模后和灌胃治疗期间每日对各组大鼠体重进行称重并记录，造模前，各组大鼠体重之间的比较差异无统计学意义。灌胃治疗2周后，造模后各组大鼠体重明显低于空白组(P<0.05或0.01)，柴胡加龙骨牡蛎汤高剂量组、中剂量组及丙戊酸钠组大鼠体重明显高于模型组(P<0.01)，柴胡加龙骨牡蛎汤中剂量组、低剂量组大鼠体重明显低于高剂量组(P<0.05或0.01)，丙戊酸钠组大鼠体重明显高于柴胡加龙骨牡蛎汤低剂量组(P<0.05)；灌胃治疗4周后，造模后各组大鼠体重明显低于空白组(P<0.01)，柴胡加龙骨牡蛎汤高剂量组、中剂量组、低剂量组及丙戊酸钠组大鼠体重明显高于模型组(P<0.01)，柴胡加龙骨牡蛎汤中剂量组、低剂量组及丙戊酸钠组大鼠体重均明显低于高剂量组(P<0.05或0.01)，丙戊酸钠组大鼠体重明显高于柴胡加龙骨牡蛎汤低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体重变化(g)

2.3 各组大鼠海马组织病理学改变 HE染色结果显示：空白组大鼠海马结构中颗粒细胞和锥体细胞分布均匀、层次分明、细胞之间的排列也比较紧密、饱满，胞浆透明颜色淡红，胞核呈椭圆形分布；模型组大鼠海马细胞肿胀、轮廓分布不均，细胞数量减少，细胞核破碎，出现细胞凋亡现象；与模型组相比，中药高、中、低剂量组和丙戊酸钠组颗粒细胞和锥体细胞数量较多，形态完整、边界清晰，分布较紧密(图1)。

2.4 各组大鼠血清炎症因子白介素6(IL-6)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)表达情况 灌胃治疗4周后，抽取各组大鼠血清采用ELISA法测定IL-6和TNF-α水平，实验结果显示：与空白组相比，造模后各组大鼠血清中IL-6 及TNF-α水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，柴胡加龙骨牡蛎汤高、中组和丙戊酸钠组的IL-6和TNF-α表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，与柴胡加龙骨牡蛎汤高剂量组相比，中剂量组和低剂量组IL-6和TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，与柴胡加龙骨牡蛎汤中剂量组相比，低剂量组IL-6和TNF-α水平均明显升高，丙戊酸钠组IL-6和TNF-α水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，与柴胡加龙骨牡蛎汤低剂量组相比，丙戊酸钠组IL-6和TNF-α均水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

A：空白组；B：模型组；C：高剂量组；D：中剂量组；E：低剂量组；F：丙戊酸钠组

表2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α表达情况

2.5 各组癫痫大鼠海马组织NF-κBp65与IκBa蛋白表达情况 灌胃治疗4周后，剥离各组大鼠海马组织，采用Western blot法测定NF-κBp65、IκBa相对表达水平。结果显示：与空白组比较各组大鼠IκBa相对表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较高剂量组、中剂量组、低剂量组与丙戊酸钠组IκBa相对表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)(图2) 。与空白组比较各组大鼠NF-κBp65相对表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较高剂量组、中剂量组和丙戊酸钠组NF-κBp65相对表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。NF-κBp65、IκBa蛋白表达在高剂量组、中剂量组、低剂量组与丙戊酸钠组之间比较，无统计学差异(P>0.05)(图3、4)。

注：与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

注：与空白组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

图4 各组大鼠海马IκBa、NF-κBp65蛋白电泳图

3 讨 论

癫痫是一种突发性，短暂性大脑神经功能失调的疾病，以突然扑倒，两目上视，口吐涎沫，口中发出猪羊叫声，甚则昏不知人的一种发作性疾病。中医认为本病的病机与突受惊恐、痰浊阻窍、血瘀、气机郁滞等有关。治法多以行气开郁，化痰逐瘀，镇心安神为主。裴新军[3]认为柴胡加龙骨牡蛎汤治疗癫痫的机理与通胆腑调气机有关，胆与心脑相通，胆属阳木，肝与胆相表里，可以疏调人体气机，柴胡加龙骨牡蛎汤以小柴胡汤为基础，可以疏调少阳气机，气机调畅，风火痰瘀等病理产物也会随之消失，癫痫就会随之缓解。

中医对癫痫的认识及柴胡加龙骨牡蛎汤应用：柴胡加龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》卷三辨太阳病脉证并治第107条：“伤寒八九日，下之……柴胡加龙骨牡蛎汤主之。”其中烦惊和谵语属于神志方面的表现，因此认为柴胡加龙骨牡蛎汤具有安神定志，调达气机的作用。本方可以看作由小柴胡汤减去甘草，加入铅丹、桂枝、茯苓、大黄、龙骨、牡蛎而成。方中柴胡舒达少阳气机，作为方中君药，人参与半夏为臣药补益中焦脾胃之气，并具有降逆止呕的作用，龙骨、牡蛎、铅丹等质重潜降之品，以敛上亢之虚阳，茯苓利小便以通阳气，大黄通大便以泻瘀热，起到釜底抽薪的功效，桂枝通阳解肌发表以除身重，生姜、大枣调和阴阳，以祛在表之邪气。本方具有调少阳枢机，镇心安神，泄热通腑的功效。《难经·二十难》中认为癫证以阴证和虚证为主，而狂证则以阳热实证为多见。但是随着病情的变化，癫证日久也可转化成狂证，狂证也可转为癫证，所以两者常常同称。癫狂多由先天禀赋不足，情志不遂气机运行受阻而引起的脏腑功能逆乱阻塞脑窍，相当于现代医学说的精神分裂症。狂证多为痰火扰神所致，治疗以泻火涤痰为主，癫病多属于气滞痰结血瘀蒙蔽心窍所致，治法以行气解郁，化痰开窍为要。柴胡加龙骨牡蛎汤可以看成是以小柴胡汤为底方来条畅少阳经之气机加桂枝温阳通络，以助膀胱气化，茯苓健脾利湿以行水，龙骨、牡蛎蛰藏闭涩之性，安神定惊使本方泄中有敛，以防疏泄太过之弊端，铅丹体重而性沉降，善入血分，有坠痰去怯的功效，故多用于治疗惊痫癫狂类疾病，大黄泄热通瘀，以止谵语，诸药同用具有疏解少阳，通阳泄热，镇心安神的功效，用于治疗阴阳逆乱，痰浊内阻，神志错乱之症，如癫狂、癫痫、不寐、郁证等神志性疾病。《经验选秘》中提到：“凡痴癫、羊癫风等症，皆痰迷心窍所致”，肺为贮痰之器，脾为生痰之源，肾为生痰之本[4]。癫痫是由于风、火、痰、惊、瘀、郁、虚上扰所致，脏腑失调从而造成血行失循、气血亏损，可累及肝、脾、肾。临床以健脾益气、养心安神、化痰、补益肝肾为治理之契机[5]。颜彦武等[6]使用药物贴服肚脐的方法，激发、疏通经络，调和气血，从而调节患儿脏腑的阴阳平衡，最终达到改善脑瘫儿童的预后。

柴胡加龙骨牡蛎汤现代药理学研究：柴胡加龙骨牡蛎汤临床应用较广泛，多用于治疗癫痫、焦虑、抑郁、失眠等神志疾病[7]。现代药理研究发现柴胡加龙骨牡蛎汤具有镇惊、催眠、抗抑郁、降血脂、防止动脉粥样硬化等作用[8]。马喜凤等[9]认为癫痫的发病与心、肝、脾三脏关系较为密切，临床用柴胡加龙骨牡蛎汤合经验方平痫汤(郁金、丹参、代赭石、天麻、僵蚕、石菖蒲)治疗癫痫效果较佳。梅国强教授[10]以柴胡加龙骨牡蛎汤为基础方加减治疗1例继发性癫痫患者，经两个月治疗后癫痫发作症状得到了完全控制。金杰教授[11]认为癫痫的发病与情志刺激影响少阳枢机有关，临床治疗由情志刺激所引起的癫痫多用疏肝利胆法，选用柴胡加龙骨牡蛎汤加减来条畅少阳气机效果较好。史金玉等[12]通过冠状动脉前降支结扎法建立小鼠心肌梗死合并焦虑模型，中药组小鼠给予柴胡加龙骨牡蛎汤灌胃治疗，结果表明柴胡加龙骨牡蛎汤可以调控NF-κB信号通路，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，从而改善心肌梗死小鼠的心肌损伤程度。邹梅[13]将癫痫患者随机分为加味组和对照组，分别给予加味柴胡加龙骨牡蛎汤合愈痫丸、愈痫丸口服治疗，治疗结果显示加味组优于对照组，有效率达93.8%。王倩等[14]实验研究发现加味柴胡加龙骨牡蛎汤可以显著降低戊四唑致痫大鼠的癫痫发作级别和发作时间，且与用药剂量呈正相关。单萍等[15]将小鼠分为对照组、模型组、中药大中小剂量组五组，并建立慢性癫痫小鼠模型，中药大中小剂量组分别给予柴胡加龙骨牡蛎汤20、10、5 ml/kg灌胃治疗7 d，实验结果表明柴胡加龙骨牡蛎汤对癫痫小鼠脑组织具有保护作用。癫痫的耐药性与多药耐药基因(MDR1)编码的糖蛋白(Pgp)密切相关，痫性发作后导致血脑脊液屏障功能暂时受损，充当第二道屏障，同时也将抗癫痫药物泵出细胞外，降低了药效[16]。癫痫的反复发作常会导致脑神经组织损伤而损伤神经元，严重者可导致认知功能障碍的发生[17]。癫痫患者往往伴有抑郁和焦虑，而抑郁和焦虑又进一步降低了癫痫患者的生活质量，增加了癫痫发作频次[18]。

柴胡加龙骨牡蛎汤对癫痫大鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α的影响：癫痫在发生和发展的过程中，大脑因为过度惊厥会出现缺氧、水肿等情况，缺氧和水肿的神经元及神经胶质细胞会不断的产生炎症因子，炎症因子又会导致神经元兴奋性增高，进一步加剧癫痫发作。炎症因子既是癫痫产生的产物，又是引起癫痫反复发作的病理影响因素。IL-6由星胶质细胞产生，TNF-α由小胶质细胞释放，IL-6和TNF-α能够破坏血脑屏障，引起大量炎症因子和细胞进入脑内，下调癫痫的发作阈值，引起癫痫发作。李国兴[19]将65例癫痫患者分成原发性48例，继发性17例，另选取30名健康者作为对照组，用ELISA法检测患者血清和脑脊液中TNF-α变化，发现癫痫患者血清和脑脊液中TNF-α含量均明显增高，因此认为TNF-α为癫痫发生过程中海马硬化的主要诱导因子。刘亚东等[20]用青霉素注射的方法制造癫痫大鼠模型，造模后用柴胡加龙骨牡蛎汤灌胃治疗，治疗结束后对脑中SOD等含量进行测定,结果发现柴胡加龙骨牡蛎汤能降低癫痫大鼠脑中氧自由基含量，保护受损神经元，发挥抗癫痫作用。故本次实验选用IL-6和TNF-α作为癫痫炎症指标，治疗结果显示，与模型组相比，柴胡加龙骨牡蛎汤高、中剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6 表达均有明显下降，差异有统计学意义；高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6表达下降明显，治疗效果优于中、低剂量，差异有统计学意义。表明柴胡加龙骨牡蛎汤治疗癫痫的机制与降低癫痫大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6的表达有关。

柴胡加龙骨牡蛎汤对癫痫大鼠海马NF-κBp65、IκBa蛋白表达的影响：在癫痫的发作过程中，会因为各种致痫因子入侵大脑损伤血脑屏障、促使胶质细胞、神经元兴奋性增加，大量分泌IL-6、TNF-α、IL-1β，进而影响到NF-κB、COX-2等下游炎症通路，基因组稳定性减弱，血管内皮异常增生，加速神经元凋亡和苔藓纤维发芽的进展过程。NF-κB参与了癫痫的炎症进展过程，IκB作为NF-κB的抑制蛋白，多数情况下，与NF-κB形成异源三聚体成分存在于细胞核中，一旦刺激和损伤影响到神经元，IκB会出现磷酸化并发生蛋白水解，NF-κB与IκB解离并发生易位从而激活下游炎症因子。周燕利等[21]将60只小鼠造癫痫模型，随机分为对照组、模型组、治疗组各20只，对照组给予0.9%氯化钠注射，治疗组给予姜黄素注射，治疗结束取材后用Western blot检测TLR4、NF-κB蛋白，结果显示：与模型组相比，治疗组TLR4、NF-κB蛋白显著下降，说明TLR4/NF-κB信号通路参与了癫痫的发展过程中，姜黄素注射可以调控TLR4/NF-κB信号通路减轻癫痫的发作次数和频率。本次实验也选取了NF-κB作为柴胡加龙骨牡蛎汤治疗癫痫的信号通路，实验结果证明，癫痫发作时，大鼠脑内NF-κBp65蛋白表达增高，IκBa蛋白表达降低，通过柴胡加龙骨牡蛎汤灌胃治疗后，NF-κBp65蛋白表降低，IκBa蛋白表达增高，且柴胡加龙骨牡蛎汤高剂量治疗效果优于中、低剂量，差异具有统计学意义，说明柴胡加龙骨牡蛎汤可以通过调控NF-κB信号通路治疗癫痫。

本文探讨了柴胡加龙骨牡蛎汤对癫痫大鼠NF-κB信号通路的影响，观察了柴胡加龙骨牡蛎汤对炎症因子IL-6、TNF-α的表达，分析了炎症在癫痫发作过程中的作用，为癫痫的发病机制及治疗思路提供依据。