重组抗原免疫印迹法排查化学发光免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体假阳性的价值

王子瑜

天津市第二人民医院感染科 （天津 300110）

梅毒血清学检测是现阶段临床诊断梅毒的主要依据，随着医药技术的发展，梅毒血清学检测方法不断进步[1]。以往梅毒血清学检测采用活梅毒螺旋体进行转种，而后用提纯的特异性抗原蛋白进行免疫印迹分析及血清凝集试验等，但该方法菌种保存及转种成本均较高，且蛋白提纯等步骤困难。近年来，临床开始应用基因工程抗原来进行梅毒血清学检测，常见的检测方法有多重免疫测定法、酶免疫试验法、金磁微粒标记免疫层析法及化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）[2]，但临床存在无梅毒病史患者、老年人或是肿瘤患者等采用上述方法检测呈梅毒血清学阳性却无法解释的情况[3]。基于此，本研究分析重组抗原免疫印迹法（recombinant antigen western blotting，RAWB）排查CLIA 检测梅毒螺旋体抗体假阳性的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月至2020年8月于我院采用CLIA 得到的梅毒螺旋体抗体阳性的血清样本66份，涉及患者64例（包含有明确二期梅毒临床表现、高龄、病程和临床症状不清晰患者及CLIA 检测结果弱阳性患者），男26例，女38例；年龄21～89岁，其中21～50岁34例（第1组），51～70岁13例（第2组），71～89岁17例（第3组）；出现二期梅毒临床症状的患者15例（在第1组内），样本17份（有2例为治疗前后双份血清）。本研究已获得医院医学伦理委员会批准，入选患者均已签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 CLIA 检测

采用干燥管抽取患者静脉血5 ml，以3 500 r/min 离心5 min，分离血清待测；仪器选用Abbott I2000 全自动化学发光免疫分析仪，对其进行常规维护及保养，并对项目行质控监测，合格后方可进行标本检测，即检测梅毒螺旋体抗体，结果由仪器给出。结果判定：阳性，S/CO 值≥1；可疑阳性，S/CO 值≥0.8且<1；阴性，S/CO 值<0.8。

1.2.2 RAWB 检测

采用重组抗原TP17、TP47、TP45及TP15等制备的NC膜检测，检测盒由康泰生物公司生产，最终以实验NC 膜条质控条带和对应抗原条带显色情况进行结果判定，具体为：阳性，质控线显色正常，至少2条抗原线显色；可疑阳性，仅1条抗原线显色；阴性，抗原线不显色；无效，未见质控线显色或显色明显下降。

1.2.3 免疫印迹法（western blotting，WB）检测

试剂盒由德国欧蒙公司生产，依据操作说明书的判断标准对66份样本进行确证试验，并将WB 阳性结果作为真阳性，操作时，取出抗原膜条并将其放入反应槽中，加入缓冲液后于室温下温育，再加入稀释过的样本，吸走槽中液体并清洗膜条3次后加入酶结合物，经温育、加入底物液等操作后，将膜条放于模板中，风干后进行分析。结果判定：阳性，IgG 于印迹膜出现针对分子量47、45、17及15 kDa 的多于1条多肽抗原条带；可疑阳性，仅出现1条多肽抗原条带；阴性，无多肽抗原条带出现。

1.3 观察指标

以WB 检测结果为金标准，分析CLIA 检测结果；比较CLIA、RAWB 及WB 检测结果；比较不同年龄组患者的RAWB 与CLIA 检测结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CLIA 检测结果

CLIA 检测第1组梅毒螺旋体抗体阳性率为94.44%（34/36），可疑阳性率为5.56%（2/36）；CLIA 检测第2组梅毒螺旋体抗体阳性率为92.31%（12/13），可疑阳性率为7.69%（1/13）；CLIA 检测第3组梅毒螺旋体抗体阳性率为82.35%（14/17），可疑阳性率为17.65%（3/17）。

2.2 CLIA、RAWB 及WB 检测结果比较

CLIA 与RAWB 的检测结果比较，差异有统计学意义（χ2=11.604，P<0.05）；CLIA 与WB 的检测结果比较，差异有统计学意义（χ2=16.500，P<0.05）；RAWB 与WB 的检测结果比较，差异无统计学意义（χ2=0.524，P>0.05），见表1。

表1 CLIA、RAWB 及WB 检测结果比较（份）

2.3 不同年龄组患者的RAWB 与CLIA 检测结果比较

两种方法检测第1组的结果比较，差异无统计学意义（χ2=0.727，P>0.05）；两种方法检测第2、3组的结果比较，差异有统计学意义（χ2=6.500、7.771，P<0.05），见表2。

表2 不同年龄组患者的RAWB 与CLIA 检测结果比较（份）

3 讨论

临床常依据临床症状及实验室检查诊断梅毒，后者包括显微镜检查、血清学检测及聚合酶链式反应等[4]。由于显微镜检查及聚合酶链式反应检出结果易受实验室条件和患者感染梅毒时间等因素的干扰，因此现阶段较常用于梅毒的实验室检查为血清学检测，其中筛查试验包括梅毒反应素试验、甲苯胺红不加热血清试验、灭活血清反应素试验等，确证试验包括梅毒螺旋体颗粒凝集试验、梅毒螺旋体血凝试验、WB 和CLIA 等，但当患者为神经梅毒、无症状先天梅毒或合并人类免疫缺陷病毒/艾滋病时，采用血清学检测诊断较困难[5]。筛查试验主要检测被感染宿主早期细胞被破坏释放出的磷脂类物质及受刺激生成的免疫球蛋白G、免疫球蛋白M 等[6]，假阳性率较高，在老年患者或合并恶性肿瘤、各种急性传染病等免疫系统异常的患者中较多见。确证试验特异度高，但抗体滴度不能反映梅毒活动性，无法判断梅毒病程[7]。

CLIA 采取混合重组抗原（TpN15、17及47）包被的微粒与被检测样本中梅毒螺旋体抗体结合，测定微粒表面梅毒螺旋体抗体所结合反应物的相对光单位（relative light unit，RLU），样本梅毒螺旋体抗体水平与RLU 成正比，比较RLU 与临界值，若RLU 大于临界值，则认为梅毒螺旋体抗体阳性；该方法效率高、成本低，已被广泛用于临床。WB 检测是通过病毒特异性抗原有关试剂来检测梅毒螺旋体抗体且其检测灵敏度和特异度均较高，为梅毒特异性抗体确证试验；考虑到目前抗原成分多为人工重组抗原制备，WB 检测的假阳性率有所上升。本研究采取优化改进的特异性病原体抗原蛋白来制作免疫印迹试剂，采用RAWB 法对66份样本的检测结果与采取病原体活体接种和提纯抗原制备的结果一致，但RAWB、WB 与CLIA 检测结果仍存在差异。临床上部分老年人、肿瘤患者、卒中人群及孕妇常出现通过CLIA 检测呈阳性却无法合理解释的情况。本研究主要选取CLIA 检测梅毒螺旋体抗体阳性样本，包含有明确二期梅毒临床表现、高龄、病程和临床症状不清晰患者及CLIA 检测结果弱阳性患者的血清，用以排查其中的假阳性情况，结果显示，RAWB 与CLIA 检测结果存在明显差异，分析CLIA 检测中或存在假阳性情况。

综上所述，CLIA 检测梅毒螺旋体抗体存在一定的假阳性情况，RAWB 可帮助临床排查假阳性结果，当患者CLIA检测结果为弱阳性时，则需根据其个体特征综合分析，必要时可通过RAWB 排查。