山东省罗庄区2种铁线莲的指纹图谱研究

杜希扬，赵治勇，彭善祥，高立虎，李 强，孙兆祥，公素琴

（山东省临沂市中医医院，山东 临沂 276002）

毛茛科铁线莲属植物在我国种类繁多，分布极广[1]。作为中药威灵仙的来源，《中国药典》仅收录威灵仙ClematischinensisOsbeck、棉团铁线莲ClematishexapetalaPall.或东北铁线莲Clematis manshuricaRupr，但全国范围内威灵仙用药比较混乱[2]。第四次全国中药资源普查中课题组发现，山东境内铁线莲属植物主要为长冬草Clematishexapetalavar.tchefouensis和太行铁线莲Clematis kirilowiiMaxim.。孙兆祥[3]通过生药学鉴定研究发现，太行铁线莲与威灵仙有着诸多共同特征，并预测其主要成分类似。徐凌川等[4]对山东省太行铁线莲薄层研究，发现其化学成分与威灵仙相似，具有潜在的药用价值。研究[5-7]通过对贵州地区威灵仙主要来源柱果铁线莲ClematisuncinataChamp.的HPLC指纹图谱分析，发现其与药典收录品种威灵仙亲缘较近。为了进一步研究长冬草、太行铁线莲与药用威灵仙的内在关系，开发山东中药资源，本课题组对其展开HPLC液相指纹图谱的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国赛默飞高效液相色谱仪：UltiMate3000系列，WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），AUW120D精密电子天平（SHIMADZU公司）。

1.2 试药

威灵仙对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121189-201102），威灵仙（棉团铁线莲）对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121578-201202），长冬草（采挖自罗庄区黑石山），太行铁线莲（采挖自罗庄区黑石山），磷酸、乙腈为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：采用乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）进行线性梯度洗脱，0～25 min（A：0.1%～4%）；25～ 30 min（A：4% ～ 13%）；30～ 60 min（A：13% ～ 25%）；60～ 80 min（A：25%～40%）；80～100 min（A：40%～60%）；100～ 120 min （A：60% ～ 80%）；120～ 140 min（A：80% ～ 100%）；140～ 160 min（A：100%～100%），体积流量：0.8 ml·min-1；柱温：25℃；检测波长：210 nm；运行时间：160 min。

2.2 供试品溶液制备

对照药材及采挖药材，分别粉碎，各取粉末（过5号筛）1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇适量，超声提取30 min，放冷，用甲醇定容至50 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 空白试验 精密吸取提取液（甲醇）10 μL，注入高效液相色谱仪，按规定梯度条件进行洗脱。结果表明空白不干扰测定。

2.3.2 分析时间确定试验 取威灵仙对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121189-201102）供试品溶液按要求进样，在洗脱 160 min 后，再保持100%乙腈洗脱20 min。经分析，长冬草经梯度洗脱，在保留时间160 min后已无成分残留。确定长冬草指纹图谱的分析时间为160 min。

2.3.3 精密度试验 取威灵仙对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121189-201102）溶液，连续进样6次，测得各峰相对保留时间和峰面积相对比值的RSD值分别为0.06%～0.88%和0.24%～1.90%，表明该方法精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取供试品太行铁线莲（罗庄黑石山）溶液6份，测得各峰相对保留时间和峰面积相对比值的RSD值分别为0.16%～0.96%和0.43%～1.78%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取供试品威灵仙对照药材（中国食品药品检定研究院，批号121189-201102）溶液，分别在 0、6、12、18、24 h检测，测得各峰相对保留时间和峰面积相对比值的RSD值分别为0.07%～0.94%和0.18%～1.70%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 建立指纹图谱

分别精密吸取各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按照2.1 项下的色谱条件，进行检测。根据不同供试品测定结果所给出的峰值、峰数和相对保留时间等相关参数进行分析，优化制定指纹图谱，见图1，图 2。

图1 威灵仙指纹图谱

图2 4种铁线莲指纹图谱

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 4种铁线莲相似度评价 将收集罗庄黑石山的2种铁线莲：长冬草和太行铁线莲各一批与威灵仙标准药材和威灵仙（棉团铁线莲）各一批的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版相似度软件，以威灵仙为参照，建立对照图谱，并进行相似度的评价，见表 1。

表1 4种铁线莲指纹图谱相似度

2.5.2 4种铁线莲峰分析 以威灵仙指纹图谱为参照图谱，经过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版分析后共计45个峰，见表2。其中4种铁线莲共有峰11个，威灵仙、威灵仙（棉团铁线莲）、太行铁线莲、长冬草共有峰面积各占其总峰面积的74.1%、78.4%、73.5%和61.0%。太行铁线莲与威灵仙的共有峰面积分别占其总峰面积的87.0%和83.0%，与威灵仙（棉团铁线莲）的共有峰面积分别占其总面积的76.7%和87.4%；长冬草与威灵仙的共有峰面积分别占其总峰面积的89.9%和89.1%，与威灵仙（棉团铁线莲）的共有峰面积分别占其总面积的62.9%和88.1%；长冬草与太行铁线莲共有峰面积分别占其总峰面积的91.4%和90.8%。

表2 4种铁线莲峰面积及保留时间

3 讨论

本实验对于药材提取试验了50%乙醇、70%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等不同的溶剂、不同的时间以及不同的提取方式，发现甲醇超声60 min药材成分提取较完全，但超声提取30 min差距不大且无稳定性差异，因此采用甲醇超声提取30 min作为药材提取方法。

色谱条件的确定过程中，以威灵仙对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121189-201102）为主，并兼顾了其他3个品种的色谱峰分离情况。试验中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2% 磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相，结果显示以乙腈-0.2%磷酸水为流动相相比其他流动相分离度高，峰形好，基线稳定；通过采用DAD（二极管阵列）检测器对检测波长进行考察，结果发现在210 nm检测波长下，威灵仙色谱中基线较平稳，信息丰富，故以此为检测波长。

我国目前铁线莲属植物约有108种，其所含化学成分多种多样，但其中主要成分为三萜类化合物[8]。通过此次试验可以发现威灵仙与威灵仙（棉团铁线莲）指纹图谱相似度较高，证实药典收录的两种药材成分相似度较高。4个品种共有11个共有峰，共有峰面积各占其总峰面积比例较高，证明其主要成分相似性较高。同时经过对比可以发现太行铁线莲与长冬草共有峰面积占各自总峰面积高达90.8%和91.4%，提示生长环境对植物主要成分影响巨大，对于道地药材可以提供侧面支持。经过实验对比，不论太行铁线莲还是长冬草,其与药典收录的2种威灵仙药材主要成分相似，但其相似成分是否为威灵仙功效的物质基础尚不得而知[9]。

随着科学技术的进步，从铁线莲中分离出不同的化合物，经现代药理学研究发现，各化学成分分别具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用[10]。威灵仙起源于北方，其自古是否存在混用尚不得而知[11]。第四次中药资源普查罗庄队发现其同属长冬草、太行铁线莲蕴藏量巨大。本课题组对其是否存在药用价值展开了文献查阅，现进行了指纹图谱的对比，下一步将建立以各有效成分组成的指纹图谱，将其与4种铁线莲对比，以期确定山东2种铁线莲是否具有药典收录的威灵仙的药用功能，以期为中药资源的应用开发提出一定的思路。