气味结合蛋白OBPs在意大利蜜蜂头部表达模式的研究

赵慧婷，彭 竹，黄 丽，郭丽娜，杜亚丽，吕建华

(1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

在长期的进化过程中，昆虫与外界环境相互作用，形成了复杂且灵敏的化学感受系统(如嗅觉和味觉系统)，在昆虫觅食、饲喂、交配、个体交流及躲避敌害等行为中发挥了重要的作用。在参与昆虫嗅觉识别的多种蛋白中，包含一类小分子量的亲水性转运蛋白——气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)。这类蛋白存在于昆虫嗅觉感受器的淋巴液中，其主要功能是结合和运输外界疏水性的气味分子到达嗅觉神经元树突状膜上，激活膜上的气味受体ORs(odorant receptors, ORs)，实现信号转导，最终通过中枢神经系统产生行为反应(Lealetal., 2013; Pelosietal., 2018)。因此，从嗅觉发生的过程可以看出，OBPs在识别气味分子和引发生理反应的途径中起到了十分重要的作用(Danietal., 2011)。

Vogt等(1981)利用传统的配体结合试验手段，从多音天蚕蛾Antheraeapolyphemus触角中鉴定到昆虫第一个OBP蛋白。近年来，高通量技术的兴起加速了昆虫OBPs基因的鉴定。而基因的表达特性常常与其功能存在着密切的联系，当基因被鉴定后，其表达谱的研究成为了一项基础性工作。Forêt和Maleszka(2006)在西方蜜蜂Apismellifera基因组中共鉴定到21个OBPs，其中的9个基因在触角中特异性表达，其余基因在各个组织或特异的组织中表达。其后，Iovinella等(2011)对21个OBPs在西方蜜蜂不同级型和不同发育期下颌腺中的表达特性及气味分子结合能力进行了研究，推测在下颌腺中高表达的OBPs可能参与了化学信息素的溶解与释放过程。

尽管昆虫OBPs起初多被证实为具有嗅觉功能，而且这类蛋白大多数表达在昆虫的触角中，然而随着OBPs基因家族成员不断被鉴定，越来越多的研究表明，OBPs除具有嗅觉功能外，还有结合其他配体等更广泛的生理功能，如在昆虫头部和足部表达的OBPs可能与味觉识别有关(Pelosietal., 2014)；在黑库蚊Culexnigripalpus和锥蝽Rhodniusprolixus的肠道转录组中发现的OBPs，被认为可能参与了转运营养物质或其它与肠道功能有关的分子(Smartt and Erickson, 2009; Ribeiroetal., 2014)。另外，在昆虫产生信息素的腺体和生殖器官中也发现了OBP基因，如棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübnerOBP10(Sunetal., 2012)和埃及伊蚊Aedesaegypti的OBP22(Lietal., 2008)，它们可能参与控制化学信息素向环境中释放的过程。

蜜蜂作为一类社会性昆虫具有很高的化学感知和通讯能力。头部是蜜蜂感觉和取食的中心，着生有眼、触角和口器，蜜蜂通过感知蜂群内部的信息素来调节和稳定蜂群高度复杂的社会活动，通过监测外界环境中的气味化合物来定位食物来源(Slessoretal., 2005)。为了进一步挖掘意大利蜜蜂OBPs的序列特征及其表达谱数据，在前人研究基础上，本研究分析了21个OBPs基因在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica不同日龄内勤蜂头部的表达模式，该试验结果也为研究昆虫OBPs更广泛的生理功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验样品的准备

意大利蜜蜂于2018年夏季采自山西农业大学实验蜂场。从3箱蜂群中分别提取正有新蜂出房的封盖子脾，置于恒温培养箱中。培养条件为：温度34℃±1℃，相对湿度75%±5%。次日，每箱中收集1日龄工蜂各10头。同时使用标记笔在新蜂胸背部进行标记，一群蜂标记约100头，标记后将巢脾带蜂放回原群中。此后，分别于4、6、8、10、12和14日龄从3群蜂中各采集10头工蜂，用无菌镊子将工蜂头部分离下来，迅速投入液氮冷冻后研磨，盛入装有1 mL Trizol的EP管中，-70℃保存备用。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol试剂盒(Invitrogen, USA)说明书提取各样品的总RNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪检测RNA的完整性及其纯度和浓度后，使用反转录试剂盒(TaKaRa, 中国大连)进行cDNA第一链合成。合成过程分两步：①基因组DNA的去除。反应总体系为10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，总RNA 1 μg，RNase Free ddH2O补足10 μL。42℃孵育2 min；②反转录。反应总体系为10 μL：5×Primer Script Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，步骤①的反应液10 μL。37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.3 引物设计

在NCBI数据库中搜索意大利蜜蜂21个OBPs基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0软件设计引物，用于RT-PCR及qPCR试验。由于OBP6与OBP8、OBP19与OBP20核苷酸序列相似性很高，分别为96%和99%，通过PCR扩增难以将其区分开来，因此这两对基因分别共用一对引物。引物详情见附表1。

1.4 RT-PCR检测OBPs在工蜂头部组织的表达

采用RT-PCR方法检测21个OBPs在8日龄工蜂头部组织的表达量。PCR扩增总体系为20 μL：1×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸8 min。以西方蜜蜂Arp1(GenBank登录号：XM_623831.6)为参照基因。

1.5 qPCR检测部分OBPs在不同日龄工蜂头部的表达量

以意大利蜜蜂Arp1为内参基因，在7500型实时荧光定量PCR仪(ABI)中采用SYBR Green法进行qPCR检测。荧光定量PCR总体系为20 μL：cDNA各1.5 μL，SYBRPremixExTaq(2×)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反应条件为：95℃预变性30 s；接着进行42个循环反应，循环条件为95℃ 5 s，60℃ 30 s。测定溶解曲线的反应条件为：95℃ 15 s，60℃ 1 min。每个样品重复3次。

1.6 21个OBPs氨基酸序列的Motif分析

利用在线软件MEME 5.2.0(http://meme-suite.org/tools/meme)对21条完整的OBPs氨基酸序列进行保守基序Motif预测分析，设置的保守Motif最大数目为6。通过Pfam 33.1(http://pfam.xfam.org/)在线分析软件对Motif进行功能注释。

1.7 数据分析

对于qPCR检测数据，根据扩增曲线获得的Ct值，在Excel中采用2-△△CT法进行数据分析。利用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，并利用GraphPad Prism 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 意大利蜜蜂OBPs基因家族的Motif预测结果

对21个意大利蜜蜂OBPs基因编码的氨基酸序列进行Motif预测分析，得到6个保守的Motif(图1)。Pfam分析结果表明，Motif 1和Motif 6均为PBP/GOBP family典型结构，其余Motif均未得到其功能结构的信息。Motif 4最短，包含15个氨基酸，Motif 6最长，由50个氨基酸组成。在所有的OBPs的氨基酸序列中都存在Motif 1(图2)，可见Motif 1是意大利蜜蜂气味结合蛋白家族十分保守的基序，且该基序中包含一个保守的半胱氨酸残基。另外，在13个OBPs中含有Motif 2，11个 OBPs中含有Motif 3，9个OBPs中含有Motif 4，7个OBPs中含有Motif 5，仅有2个OBPs中含有Motif 6。从Motif排布位置来看，Motif 4和Motif 5的位置较为固定，Motif 4位于第1～15位aa，Motif 5位于第75～95位aa。

图1 意大利蜜蜂OBPs的Motif结构类型

图2 意大利蜜蜂OBPs Motif的组成及排布

对Motif的结构和分布进行对比分析，可以将21个OBPs分为4种类型，OBP15～OBP21均含有相同的5个Motif(Motif 1～Motif 5)，且Motif的排布位置一致，而OBP13和OBP14的Motif结构与之相似，因此可以将它们归为一类；OBP6和OBP8的结构相似，在其氨基酸序列中Motif 3、Motif 1和Motif 6依次排列；OBPs 1、9、10和11均含有两个Motif(Motif 1和Motif 2)；OBPs 2、3、4、5、7和12仅含有1个Motif(Motif 1)。

2.2 OBPs在意大利蜜蜂工蜂头部表达量的定性分析

利用RT-PCR检测了各OBPs在4日龄意大利工蜂头部的表达量，RCR扩增后的凝胶电泳结果见图3。由图可见，内参基因Arp1的扩增条带(A图第10泳道，B图第11泳道)清晰，无拖尾，说明模板cDNA质量良好，可以通过电泳条带的亮度初步判断目的基因的表达量。图3中，OBPs1-5、6/8、10、14、15、17、18、19/20和21的条带较亮，表明这13个基因在意大利蜜蜂工蜂头部均有表达，而OBPs7、9、11、12、13和16的条带较弱，说明这6个基因在工蜂头部表达量较低，因此未参与后续qPCR试验。

图3 21个OBPs在工蜂头部组织RT-PCR扩增结果

2.3 部分OBPs在意大利蜜蜂工蜂头部表达量的定量分析

对RT-PCR试验筛选出的13个扩增条带较亮，即在内勤蜂头部表达量较高的OBPs基因，进一步利用qPCR进行定量检测分析。

首先，以OBP3基因mRNA表达量为基准，分析了13个OBP基因在4日龄和8日龄工蜂头部的相对表达量。从两个表达谱综合分析结果可以看出，OBPs1、2、4、6/8和21在工蜂头部的表达量较高，而OBPs5、10和19的表达量相对较低(如图4所示)。qPCR结果中大部分基因的表达情况与RT-PCR的结果相符。

图4 13个OBPs基因在工蜂头部组织的表达量

其次，以各基因8日龄mRNA的表达量为基准，对13个OBPs在内勤蜂不同发育阶段(1～14日龄)基因表达量的变化进行了分析(见图5)。值得注意的是，在13个OBPs中，大多数基因(11个OBPs)均是在4日龄时表达量最高。其中，OBPs15、17、18、19/20和21的表达模式相似，即1日龄表达量最低，4日龄表达量最高，6日龄、8日龄的表达量依次降低，10日龄、12日龄和14日龄表达量再次降低，但3者间差异不显著；OBPs2、3、5和OBP6/8的表达模式相似，即1日龄表达量最低，4日龄表达量最高，6～14日龄表达量差异不大；OBP1和OBP4表达模式相似，即4日龄表达量最高，1日龄次之，其余日龄表达量均较低，14日龄表达量最低。OBP10和OBP14的表达情况较为特殊，OBP10在1日龄时表达量最高，随日龄的增加表达量逐渐降低；OBP14在6日龄时表达量较高，10～12日龄表达量较低。

图5 13个OBPs在不同日龄工蜂头部组织的表达模式

3 结论与讨论

蜜蜂同其它社会性昆虫类似，利用自身复杂的化学通讯系统，调节不同性别、不同级型和不同群体间的关系，以及同一群体内不同个体间的分工合作(Slessoretal., 2005)。另外，蜜蜂还能够识别与其有亲属的关系的其它个体，单倍体的雄蜂和病死的个体(Swansonetal., 2009)。昆虫化学感受过程中涉及许多不同种类的蛋白，如气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)、气味受体(ORs)、神经元膜蛋白(SNMPs)和气味降解酶(ODEs)等，这些蛋白将结合的化学配体的信息传递给中枢神经产生行为反应。研究已证实，在昆虫触角中高表达的OBPs主要行使嗅觉功能(Lealetal., 2013; Qiuetal., 2018)，而目前的一个重要任务是解析在其它组织中广泛表达的OBPs的非嗅觉功能。

蜜蜂的OBPs共有21个家族成员，其数量比黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(52个)、冈比亚按蚊Anophelesgambiae(69个)、德国小蠊Blattellagermanica(109个)少很多(Hekmat-Scafeetal., 2002; Vieira and Rozas, 2011; Robertsonetal., 2018)，但与同属于社会性昆虫的火红蚁Solenopsisinvicta的数量(18个)相近(Gotzeketal., 2011)，属于小型的基因家族，然而这也为系统地研究这一家族的进化及功能提供了有利的条件。目前，已开展了对蜜蜂OBPs的表达(Forêt and Maleszkaetal., 2006; 杜亚丽等，2016；2019)、结构(Lartigueetal., 2004；Spinellietal., 2012)、与气味分子的结合能力及结合位点(Langeswaranetal., 2018; Songetal., 2018)等方面的研究。

Motif通常是一些有序列特异性蛋白的结合位点的短序列，与基因的表达调控相关。通过对意大利蜜蜂21条OBPs氨基酸序列中6个Motif进行比较分析得出，Motif 1是21个OBPs所共有的基序结构，推测这一Motif很可能与底物的结合密切相关。Motif 6仅在OBP6和OBP8中存在，这一基序是否与底物结合的特异性有关还有待进一步研究。另外，从21个OBPs的Motif组成及排布来看，OBPs 13～21的Motif结构相似，OBP6和OBP8的结构相似，这一结果与Forêt和Maleszka(2006)采用neighbor-joining 法建立的蜜蜂OBPs系统进化树结果类似。但是在进化树中OBP5与OBP6和OBP8被归为一个分支，与本研究的归类结果不一致，对其具体功能的分类还需要更进一步的试验支持。

Forêt和Maleszka(2006)利用反向斑点杂交技术(Reverse Northern dot blot hybridization)分析了西方蜜蜂OBPs在不同级型、不同组织和不同发育阶段(幼虫、蛹、1日龄幼蜂和采集蜂)的表达量，结果显示，除OBP10和OBP14外，其余基因在头部表达量均较低。而本研究分析结果表明，除OBPs7、9、11、13和16在工蜂头部表达量较弱外，其余OBP基因均有表达，且OBPs1、2、4、6/8和21表达量较高。造成两研究结果差异的原因可能是由于试验方法不同，通常RT-PCR和qPCR检测方法比Northern印迹更加灵敏，因此得到的表达量也不尽相同。

不同发育时期表达谱分析表明，在意大利内勤蜂头部有表达的OBPs中，多数在4日龄表达量较高，6日龄后表达量均较低，推测这些OBPs可能具有类似的功能。在正常的蜂群中，3～6日龄的工蜂主要承担调制蜂粮饲喂大幼虫的工作；6～12日龄工蜂王浆腺发达，可分泌大量王浆，从事饲喂小幼虫、蜂王等工作；12～18日龄的工蜂蜡腺发达，可从事泌蜡造脾、清洁卫生、酿蜜等工作(曾志将，2017)。头部是蜜蜂感觉和取食的中心，在其表面分布着大量的嗅觉和味觉感受器(Matsuoetal., 2007)。因此本研究推测在4日龄工蜂头部表达量较高的OBPs可能参与了幼虫信息素和糖类物质的识别。

本研究对意大利蜜蜂气味结合蛋白OBPs基因家族的氨基酸序列进行Motif分析，鉴定到一个十分保守的Motif结构，长度为21个氨基酸，包含一个保守的半胱氨酸残基。21个OBPs基因中有13个在内勤蜂头部有表达，其中OBPs1、2、4、6/8和21表达量相对较高，且大多数基因在4日龄时表达量达到最高，这些OBPs可能参与了意大利蜜蜂对巢内蜂粮等甜味物质及幼虫信息素的识别过程。