miRNA⁃199a⁃5p在热损伤人皮肤成纤维细胞中的表达及其功能研究

熊 亮，胡 寅，王立夫，曹咬脐，钱莉丽，刘泾科

1南京医科大学附属江苏盛泽医院整形烧伤科，江苏 苏州 215228；2南京医科大学第一附属医院整形烧伤科，江苏 南京210029

miRNA是一类较短的单链RNA，参与许多靶基因的表达与调控，影响细胞生物学功能［1-2］。miRNA⁃199a作为高度保守microRNA，在正常皮肤和肿瘤细胞中表达丰富，影响细胞的增殖和迁移［3-4］。目前对miRNA⁃199a⁃5p的研究主要集中在癌细胞［5-6］，本研究构建人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts HSF）热损伤模型［7］，通过逆转录实时定量PCR 对miRNA⁃199a⁃5p 的表达量进行检测，分析热损伤对HSF 增殖和迁移功能的影响；用miRNA⁃199a⁃5p 模拟物转染热损伤细胞，观察其对热损伤细胞的增殖和迁移能力［8］，旨在为由热损伤引起的皮肤功能恢复提供研究依据。

1 材料和方法

1.1 材料

正常HSF 购自无锡博慧斯生物医药科技有限公司。低糖细胞培养液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine Serum，FBS）购自美国Gibco 公司；RNA 提取试剂（TRIzol）、LipofectamineTM 2000 转染试剂、RT⁃PCR 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；microRNA mimics（5′ ⁃CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGU ⁃CUGAACACUGGGGUU⁃3′）、阴性对照mimics（5′⁃CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGUC⁃UGAACACUGGGUU⁃3′）购自苏州吉玛生物科技有限公司；U6 RT 引物（5′⁃CGAGCACAGAATCGCTT⁃CACGAATTTGCGTGTCAT⁃3′）、miR⁃199a⁃5p RT 引物（5′⁃GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC⁃GCACTGGATACGACGAACAG⁃3′）、U6 扩增引物（正向引物：5′⁃CGAGCACAGAATCGCTTCA⁃3′；反向引物：5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACATAT⁃3′）、miR⁃199a⁃5p 扩增引物（正向引物：5′⁃GTGCAGGGTCCGAGG⁃TATT⁃3′；反向引物：5′⁃CTAACCCAGTGTTCAGAC⁃TAC⁃3′）由苏州金唯智公司合成；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自上海碧云天生物公司；Transwell小室（康宁公司，美国）；Matrigel（B&D 公司，美国）；转染试剂Lipo2000（Invitrogen公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

复苏后的HSF常规培养，FBS浓度为10%，胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 HSF热损伤处理及热损伤模型的制作

细胞生长至80%～90%，胰蛋白酶消化，分成3个培养皿进行培养：对照组和实验组的培养皿均用封口膜封好，两个热损伤组在同一温度（52 ℃）水浴中热损伤不同时间（30 s和60 s），对照组细胞悬液培养皿在37 ℃水浴中水平面下浸泡30 s。细胞均保持在水平面以下。分别在0 h和24 h进行拍照，并结合瑞⁃姬氏染色法观察热损伤对HSF形态的影响。HSF热损伤模型的制作参照文献［7］：将封口膜密封的培养皿放入52 ℃水浴箱中水平面下浸泡30 s。

1.2.3 MTT实验

将经过热损伤处理的HSF（52 ℃30 s）计数，调节细胞数量至25 000个/mL，每孔200 μL，加入到96孔培养板中。一组培养24 h，另一组培养48 h。培养结束时，每孔分别加入MTT 20 μL，2 h后加入DMSO溶解，570 nm处测吸光度值。

1.2.4 实时定量PCR

将经过热损伤处理的HSF（52 ℃30 s）分为两组，一组培养24 h，另一组培养48 h。收集培养皿中的细胞，用TRIzol 试剂提取细胞miRNA。配制逆转录及PCR 扩增体系。逆转录条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃失活2 min。PCR 条件为：94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40 个循环后72 ℃继续延伸10 min。通过2-△△Ct法检测miR⁃199a⁃5p的相对含量。

1.2.5 细胞迁移实验

将经过热损伤处理的HSF（52 ℃30 s）调节细胞密度，以过夜铺满为准，接种于6孔板。用100 μL 的枪头在每孔中线轻轻划过，PBS 清洗。用FBS 浓度为4%的DMEM 培养基补充培养液至3 mL/孔。培养24 h后观察细胞的迁移。

1.2.6 细胞侵袭实验

在Transwell 小室膜的上室面加入稀释后基质胶（基质胶与无血清培养稀释比例为1∶7），每孔100 μL，30 min 后吸掉基质胶。将HSF 用DMEM 制成无血清悬液，在上室层各加入250 μL，细胞数为1.5×104个/孔。下室加入10%FBS的DMEM，常规培养24 h。擦净上室面细胞，用4%的多聚甲醛固定下室面剩余细胞，Giemsa 染色，统计细胞个数，以每个小室的平均细胞数为最终计数。

1.2.7 细胞转染实验

HSF稳定传代2～3代，待细胞长满70%时，消化接种至6孔板中继续培养。细胞正常生长后制作热损伤模型（52 ℃30 s）。模拟物组，用100 pmol miR⁃NA⁃199a⁃5p模拟物加5 μL 转染试剂混合转染细胞；对照组，用100 pmol的阴性对照模拟物加5 μL转染试剂Lipo2000 混合转染细胞。添加DMEM 培养液至1 mL/孔。4 h 后更换培养液，用10%FBS 的DMEM继续培养。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，定量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验或方差分析进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热损伤对正常HSF形态的影响

正常HSF 呈梭形或三角形，个体饱满，细胞膜光滑透亮。热损伤后HSF 变圆钝，体积增大，表面有较多突起，胞浆中有大量的异常疏松透亮区，核浆比例变小（图1）。

图1 热损伤对HSF形态的影响（Giemsa染色，×200）Figure 1 Effects of thermal injury on HSF morphology（Giemsa staining，×200）

2.2 热损伤对HSF增殖的影响

热损伤24 h 和48 h 后，HSF 增殖明显受到了抑制。相对于正常细胞增殖，热损伤24 h后细胞平均抑制率为（17.10±3.21）%（P＜0.002，n=3）、热损伤48 h 后细胞平均抑制率为（25.93±1.74）%（P＜0.001，n=3，图2）。

图2 热损伤对HSF增殖的影响Figure 2 Effects of thermal injury on proliferation of HSF

2.3 热损伤对HSF miR⁃199a⁃5p表达的影响

荧光实时定量PCR结果见表1。热损伤后HSF miRNA⁃199a⁃5p的表达明显得到了抑制（图3），24 h HSF miRNA⁃199a⁃5p 表达率为（2.67±0.35）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.001），48 h表达率为（18.42±0.44）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图3 热损伤对HSF miRNA⁃199a⁃5p表达的影响Figure 3 Effects of thermal injury on miRNA⁃199a⁃5p expression in HSF

表1 24 h、48 h热损伤HSF miRNA⁃199a⁃5p qRT⁃PCR结果Table 1 miRNA⁃199a⁃5p qRT⁃PCR results of thermal injury HSF at 24 h and 48 h（n=4，）

表1 24 h、48 h热损伤HSF miRNA⁃199a⁃5p qRT⁃PCR结果Table 1 miRNA⁃199a⁃5p qRT⁃PCR results of thermal injury HSF at 24 h and 48 h（n=4，）

2.4 热损伤对HSF迁移的影响

热损伤后，HSF 细胞迁移速率明显降低。显微镜下进行细胞计数（n=4），对照组计数结果为（24.75±2.06）个，热损伤组计数结果为（8.75±2.06）个，热损伤对细胞迁移的抑制率为（35.35±7.07）%，与对照组比较迁移功能下降（P＜0.001，图4）。

图4 热损伤对HSF迁移的影响Figure 4 Effects of thermal injury on HSF migration

2.5 热损伤对HSF侵袭的影响

热损伤后，HSF 侵袭速率明显降低。显微镜下进行细胞计数（n=4），对照组细胞数量为（21.00±5.56）个，热损伤组细胞数量为（12.00±2.58）个，热损伤对细胞侵袭的抑制率为（57.14±9.52）%，与对照组比较侵袭功能亦下降（P＜0.007，图5）。

图5 热损伤对HSF侵袭的影响Figure 5 Effect of thermal injury on HSF invasion

2.6 miRNA⁃199a⁃5p 模拟物对热损伤后HSF 增殖的影响

加入阴性模拟物组的细胞增殖率为（104.52±5.46）%，加入miR⁃199a⁃5p 模拟物组的细胞增殖率为（136.55±6.14）%，后者的热损伤细胞增殖明显升高（P＜0.003，n=3，图6）。

图6 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF增殖的影响Figure 6 Effects of miRNA⁃199a⁃5p mimics on prolifera⁃tion of HSF after thermal injury

2.7 miRNA⁃199a⁃5p 模拟物对热损伤后HSF 侵袭的影响

显微镜下对侵袭的细胞进行计数（n=4），加入阴性对照模拟物组细胞数量为（9.00±2.16）个，细胞侵袭率为（112.50±18.75）%；加入miR⁃199a⁃5p 模拟物组细胞数量为（15.75±1.71）个，细胞侵袭率为（196.88±15.63）%，后者的热损伤细胞侵袭率明显升高（P＜0.003，图7）。

图7 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF侵袭的影响Figure 7 Effects of miRNA⁃199a⁃5p mimics on invasion of HSF after thermal injury

3 讨论

在深度烧伤及热压伤中，真皮细胞的代谢、功能、形态等都发生了病理性改变。能够可逆修复创面、恢复功能的间生态真皮是影响手术修复及预后的重要因素［9］。临床治疗过程中，医生时常处于尽可能去除坏死组织和保留间生态组织两难的境地，通过研究影响变性真皮转归的重要因素及其机制，可以为临床治疗提供更多的理论依据。真皮中含有多种细胞，HSF是其中的重要细胞之一，它由胚胎时期的间充质干细胞分化而来。深度烧伤及热压伤后HSF增殖并迁移至创面，大量分泌胶原纤维及各种生长因子，还可以和新生毛细血管、各种炎症细胞形成肉芽组织促进创面的愈合，在创面修复过程中发挥着重要作用。

作为高度保守的micorRNA，miRNA⁃199a⁃5p 广泛存在于皮肤、炎症反应、血管内皮细胞、癌细胞中，参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等活动与功能［4，6，10-12］。研究发现，过表达miRNA⁃199a⁃5p 后，U2OS细胞的增殖能力显著降低（P<0.05），同时cy⁃clin D1、p Rb表达水平显著下降，而P27、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1 的表达水平显著增加（P<0.05）［5］。miR⁃199a⁃5p 通过调节EGF、SP1 下调ERK5 的表达并抑制其磷酸化，进而发挥对乳腺癌MDA⁃MB⁃231 细胞侵袭的抑制作用［13］。

大鼠真皮热压伤实验显示，在不同时间点获取组织样本，检测样本中miRNA⁃199a⁃5p 的相对表达量，结果显示miRNA⁃199a⁃5p 相对表达量为先抑制后上调的趋势［14］。推测在大鼠皮肤组织受损初期，真皮层受到影响，变性真皮细胞在短时间内无法恢复正常功能，因此细胞内miRNA⁃199a⁃5p 的表达量相对减少，表现为表达抑制。此结论可能也适用于人的皮肤组织。因此，本研究利用HSF，通过构建热损伤模型观察细胞的形态变化，检测细胞中miRNA⁃199a⁃5p表达量的变化，以及人为干扰miRNA⁃199a⁃5p表达量来观察热损伤对HSF的影响。

本研究观察到，热损伤模型中HSF形态发生了改变，miRNA⁃199a⁃5p表达量显著下调，并显著抑制HSF 的增殖、迁移和侵袭能力。通过转染模拟物的方式提高热损伤人成纤维细胞中miRNA⁃199a⁃5p的量，可以显著提高热损伤细胞的增殖和侵袭能力，提示HSF热损伤后的细胞功能与miRNA⁃199a⁃5p的表达量密切相关。这与之前的动物实验结果相对应。而如何在皮肤热损伤后提高人皮肤成纤维细胞中miRNA⁃199a⁃5p 的表达量，加快热损伤皮肤的恢复与治疗，成为下一步研究的方向。