长链非编码RNA(NR_027032、NR_047116、NR_104181)及环境因素与高血压病的关联研究

杨 乐，林佳冰，魏东红,3，张廷星，林少炜，谢骁旭，吴思英

高血压病是最常见的心血管疾病，伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害，也是其他心血管疾病最常见的危险因素。世界卫生组织估计，超过50%的心血管疾病由血压升高引起[1-3]。据统计，全球成年人口中高血压病患者约占25%，预计2025年，全球成年高血压病人数将高达15.6亿，每年有940万人因高血压病死亡[4-6]。研究表明，原发性高血压发病受到遗传因素与环境因素的共同作用，而表观遗传修饰尤其是长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)则可能作为其相互作用的“桥梁”，参与高血压病的发生发展[7]。在血管内皮细胞的lncRNA相关研究中发现，lncRNA可通过多种方式作用于内皮细胞[8]。研究表明，lncRNA 21可调控新生内皮细胞的形成[9]，而lncRNA NR_104160被确定为高血压病的潜在生物标志物[10]。本课题组前期lncRNA芯片生物信息学分析结果提示，lncRNA NR_027032(AGAP2 antisense RNA 1, AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A antisense RNA 1, HIF1A-AS1)和NR_104181与心血管疾病有关[11]。本研究拟探讨lncRNAs、环境因素与高血压病的关联，为高血压病的防治及表观遗传机制探讨提供基础。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2015年9月—2017年3月就诊福州某三级甲等医院的439例高血压病患者作为病例组，取性别、年龄均衡可比的439例非高血压病患者为对照组，采用PASS 11.0软件计算样本量。根据课题组前期结果，以OR值较小的研究因素进行计算，取α=0.05，β=0.10，P0=0.507，OR=0.542，n1=n2=300例。

1.2 方法 通过面对面访问、查看病历、测量血压、体格检查，在征得患者知情同意后，了解患者的一般人口学特征、行为情况、心理状态。体格检查包括体质量、身高、腰围。

1.2.1 诊断标准 吸烟指每日吸烟≥ 1 支，时间≥6个月者[12]；被动吸烟指不抽烟的人每周至少2 d吸取其他吸烟者喷吐的烟雾15 min[13]。高血压病的诊断参照《中国高血压防治指南2018》[收缩压(systolic blood pressure, SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)和(或)舒张压(diastolic blood pressure, DBP)≥90 mmHg]。采用SDS抑郁自评量表(self-rating depression scale, SDS)与4种性格类型探究心理因素。体质量指数(body mass index, BMI)=体质量(kg)/身高2(m2)，其中18.5～24.0为正常体质量，<18.5为消瘦，24.0≤BMI<28.0为超重，BMI≥28.0为肥胖。腰围(waist circumference, M62)经脐部中心的水平围长，用软尺测量，在呼气之末、吸气未开始时测量。M62≥90(男性)或≥85 cm(女性)定义为腹型肥胖[14]。

1.2.2 测量方法 血压测量前30 min内要求每位研究对象禁烟、避免饮用含有咖啡因的饮料及剧烈运动，静坐休息5 min后测量2次坐位血压，重复测量间隔2 min，取2次读数的平均值记录。

1.2.3 实验方法 获取健康检查资料后，按照性别、年龄进行频数匹配，取得研究对象知情同意后，选取62例病例组和对照组血样进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)实验，测定外周血白细胞lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181的表达量。引物序列见表1。以GAPDH为内参照，采用 Trizol 法提取总 RNA，并进行逆转录，取适量通过总RNA合成的cDNA作为模板进行扩增。运用2-△△CT法计算3条lncRNA的表达量。

表1 引物序列

1.3 统计学处理 采用Epidata3.1、SPSS 25.0软件录入并分析数据。计数资料以n(%)表示，采用χ2检验；计量资料非正态分布，采用非参数检验。多因素筛选采用多因素Logistic回归模型，并计算比值比(odds ratio, OR)及其95% CI。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况比较 病例组和对照组的性别、年龄可比，且人口学特征比较，差别无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 一般人口学特征

2.2 环境因素 将是否患有高血压病(0=否，1=是)作为因变量，以年龄、性别、学历、职业、婚姻、饮酒情况、饮茶情况、被动吸烟、清淡、腹型肥胖、抑郁程度、BMI、性格类型作为自变量，以输入法进入多因素Logistic回归分析，变量赋值表见表3。清淡饮食是高血压患病的保护因素，而其危险因素包括被动吸烟、超重肥胖、腹型肥胖、A型性格、抑郁(表4)。

表3 高血压病环境影响因素变量赋值表

表4 高血压病环境影响因素的多因素Logistic回归分析

2.3 lncRNA的表达情况 与对照组比较，病例组的NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181的表达量较低，差别有统计学意义(P<0.05，图1)。

各组数据以P50(P25,P75)表示。与对照组比较，△：P<0.05；△△：P<0.001；△△△：P<0.000 1。

2.4 lncRNA与高血压患病的关联分析 将是否患有高血压病(0=否，1=是)作为因变量，以年龄、性别、学历、抑郁程度、婚姻、BMI与lncRNAs的表达量作为自变量，以输入法进入多因素Logistic回归分析。结果显示，在控制其他影响因素后，NR_047116(HIF1A-AS1)及NR_104181低表达可能是患高血压病的危险因素(表5)。

表5 高血压病表观遗传因素的Logistic回归分析

3 讨 论

原发性高血压病的病因复杂，受到生物遗传、社会心理因素、环境因素的交互影响。本研究对高血压病的环境影响因素分析发现：被动吸烟、腹型肥胖、抑郁、超重肥胖、A型性格可增加高血压病的患病风险，而清淡饮食可减少高血压病的患病风险。本研究结果与《中国高血压健康管理规范(2019)》提示类似，高血压病发生发展的影响因素包括心理状态不佳、饮食不健康、超重及各型肥胖等[14]。本研究中，性情急躁、冲动人群或抑郁患者的高血压病患病风险显著高于心理状态稳定的人群，提示心理因素与高血压患病存在关联。但既往研究证实，高血压病患者由于长期伴有慢性病，可能出现抑郁等不良情绪，从而使得生活质量下降，对病情控制造成不利影响[15]。因此，心理因素与高血压之间的因果关联还需要通过队列研究等进一步探索。本研究结果亦显示，超重肥胖及腹型肥胖者高血压病的患病风险高于正常体质量或消瘦人群。既往的研究表明，高脂肪分布与肥胖有关，且肥胖人群左心室内径、面积和容积均高于健康人群，影响心脏结构与功能，这些均与高血压病的病因密切相关[16-17]。强化人群健康宣教，提高其对高血压病的认知，注重体质量及身型管理，改变不良生活方式及饮食习惯，仍是降低人群血压升高风险的最有效措施。

除了环境、心理因素的影响，表观遗传因素在疾病产生过程中也发挥着作用[10]。本研究结果显示，病例组外周血白细胞中lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181表达水平较对照组低。近年来研究显示，影响高血压病发生发展的生理机制中包括能够塑造染色体构象、细胞增殖、调节变构酶活性的lncRNAs[18-19]。研究显示，细胞周期调节剂的基因表达与NR_027032呈负相关，且该条lncRNA上调能够抑制内皮细胞增殖，影响其功能[20-21]。细胞实验证明，NR_047116与血管内皮的发育过程相关，其下调能够可能导致血管内皮过度增殖导致动脉粥样硬化[22]。NR_104181可能参与内皮细胞相关的炎症反应，从而造成血管功能紊乱[23]。本研究结果亦显示，在控制其他影响因素后，NR_047116(HIF1A-AS1)及NR_104181低表达可能是高血压病的危险因素，lncRNAs可能通过参与血管炎症反应、内皮细胞功能紊乱等生理机制影响高血压病发生发展的过程，有待进一步探索。前述与高血压病患病有关联的lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)在调整影响因素后，结果显示无关联，考虑原因为样本量较少。由于样本量原因未进行环境因素与lncRNAs交互作用的具体分析，后期应加大样本量进一步验证。

本研究存在一定的局限性。首先，病例与对照的样本均来自同一医院，可能存在入院率偏倚导致研究对象代表性不足；其次，由于仅对lncRNAs进行单次检测，难以动态评价lncRNAs，不能进行lncRNAs与高血压病的因果关联推断。后期研究中将更加注重研究对象的代表性，并进行指标动态检测，以增加结论的可靠性。